細(xì)胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位對NAFLD肝細(xì)胞線粒體功能的影響

官清華，丁啟龍(中國藥科大學(xué)藥學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，江蘇南京211198)

細(xì)胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位對NAFLD肝細(xì)胞線粒體功能的影響

官清華，丁啟龍△
(中國藥科大學(xué)藥學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，江蘇南京211198)

［摘要］目的:研究細(xì)胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位( EhCys/CySS)對非酒精性脂肪肝( NAFLD)肝細(xì)胞線粒體功能的影響。方法:用EhCys/CySS分別為0 mV(氧化)、－80 mV(正常)和－150 mV(還原)的氧化還原培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞株LO2并采用油酸誘導(dǎo)細(xì)胞建立NAFLD模型。熒光探針DCFH-DA和MitoSOX分別檢測細(xì)胞整體水平和線粒體活性氧簇( ROS)生成，使用apocynin( NADPH氧化酶抑制劑)和MitoQ(10)(靶向線粒體抗氧化劑)、rotenone(線粒體呼吸鏈復(fù)合體I抑制劑)和antimycin A(線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ抑制劑)作用細(xì)胞檢測線粒體復(fù)合體活性從而探究ROS的來源，JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果:油酸誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型使肝細(xì)胞內(nèi)ROS增多，線粒體膜電位下降;氧化的EhCys/CySS加劇了NAFLD肝細(xì)胞ROS的生成以及線粒體膜電位的下降，而還原的EhCys/CySS能清除ROS并逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的下降。線粒體ROS清除劑MitoQ(10)能顯著地減少氧化的EhCys/CySS所增加的ROS，而apocynin效果不明顯。Rotenone作用于細(xì)胞后，ROS的增長率與細(xì)胞外EhCys/CySS有關(guān)，氧化狀態(tài)下ROS增長率最小且復(fù)合體I活性減弱，即氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復(fù)合體I增加ROS的生成。結(jié)論:氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復(fù)合體I，從而加劇NAFLD肝細(xì)胞ROS的生成，并使線粒體膜電位進一步下降，而還原的EhCys/CySS能減少高脂所致ROS生成并減輕線粒體損傷。

［關(guān)鍵詞］半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位;活性氧;非酒精性脂肪肝;線粒體

如今，越來越多的研究者關(guān)注細(xì)胞外氧化還原狀態(tài)對細(xì)胞內(nèi)過程及細(xì)胞功能的調(diào)控作用。Jones等［1-2］研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸( cysteine，Cys) /胱氨酸( cystine，CySS)電對是人體血漿中最主要的小分子量硫醇/二硫化物物質(zhì)對，Cys/CySS電對的電位( Eh)能用來評價及量化細(xì)胞外的氧化還原狀態(tài)，且人正常血漿EhCys/CySS為－80 mV，氧化的血漿電位( EhCys/CySS＞－62 mV)往往伴隨著疾病。基于這一理論，大量研究證明EhCys/CySS能調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞內(nèi)過程，包括增殖、黏附、分化及凋亡［3-6］，涉及多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，包括動脈粥樣硬化、肥胖和糖尿病［4-5，7］。此外，繼Jones等［2］發(fā)現(xiàn)2型糖尿病、化療及心血管疾病的早期癥狀伴隨血漿EhCys/CySS氧化，Imhoff等［5］研究表明高脂飲食會導(dǎo)致C57B16小鼠血漿EhCys/CySS氧化，氧化的EhCys/CySS能加劇脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成，而還原的EhCys/CySS能減少脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的含量。由此可見，血漿中EhCys/CySS在高脂致脂質(zhì)代謝性疾病的形成過程中可能起著重要的調(diào)控作用。高脂飲食所致的非酒精性脂肪肝( nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)作為常見的脂質(zhì)代謝性疾病，常常是肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化的并發(fā)癥。既往研究表明在高脂所致的NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激起著關(guān)鍵作用［8］。因此，本實驗主要觀察細(xì)胞外EhCys/CySS對高脂培養(yǎng)的LO2肝細(xì)胞ROS生成、來源及線粒體功能的研究，以進一步了解高脂致NAFLD的病理生理機制。

材料和方法

1實驗材料

1.1實驗細(xì)胞LO2人正常肝細(xì)胞株由中國藥科大學(xué)藥學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心提供。

1.2主要實驗儀器及試劑Olympus BX51型熒光顯微鏡; Thermo Scientific Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀; DMEM、Cys-free DMEM培養(yǎng)基( Gibco) ; Cys、CySS( AMRESCO) ;熒光探針MitoSOX ( Invitrogen) ;油酸、熒光探針DCFH-DA、antimycin A ( Sigma) ; apocynin( TCI) ; Rotenone(阿拉丁公司)。Cys、CySS儲備液:取適量Cys和CySS溶于Cys-free DMEM，分別配成10 mmol/L的Cys和10 mmol/L的CySS儲備液。

2實驗方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組將LO2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清及青霉素-鏈霉素)中，置于37℃、5% CO2、具有一定濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，2 d換1次液。傳代分瓶設(shè)對照( control，C)組和油酸( oil acid，OA)組，每組又設(shè)有0 mV(氧化)、－80 mV(正常)和－150 mV(還原)電位梯度，每3 h換新鮮電位培養(yǎng)基至細(xì)胞達到80%，OA組加油酸再孵育6 h且油酸終濃度為0. 3 mmol/L，模擬高脂飲食造肝細(xì)胞NAFLD模型［9］。

2.2Cys/CySS電位液的配置根據(jù)人血漿中Cys 和CySS濃度［10］，調(diào)節(jié)Cys-free DMEM培養(yǎng)基中Cys 和CySS濃度，配制成相應(yīng)的電位液。即將10 mmol/ L的Cys和CySS儲備液添加到Cys-free DMEM中得到不同的EhCys/CySS電位液［11］，電位的計算符合能斯特方程: Eh=－250 +30 log(［CySS］/［Cys］2) (電位單位: mV;濃度單位: mol/L)。配置1 mL EhCys/ CySS電位液所需的CySS和Cys儲備液量見表1［3］。

表1　Cys/CySS電位液中Cys和CySS的濃度Table 1.Redox media formulations with Cys and CySS

2.3熒光顯微鏡及全波長掃描式多功能讀數(shù)儀檢測ROS［5］細(xì)胞用電位液和油酸處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，用檢測活性氧的熒光探針DCFH-DA ( 10 μmol/L，檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)或者MitoSOX( 5 μmol/L，檢測線粒體內(nèi)的ROS，激發(fā)波長510 nm，發(fā)射波長580 nm) 于37℃分別繼續(xù)孵育細(xì)胞30 min和10 min。然后用PBS洗3次，除去未進入細(xì)胞的熒光探針。加入2 mL PBS，熒光顯微鏡檢測拍照并傳代法收集細(xì)胞，全波長掃描式多功能讀數(shù)儀檢測各組熒光強度，實驗重復(fù)3次。

2.4熒光顯微鏡檢測線粒體膜電位細(xì)胞用電位液和油酸處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入JC-1染液，使終濃度為1. 5 mg/L，37℃孵育30 min，PBS 洗3遍后用熒光顯微鏡檢測。當(dāng)JC-1濃度低或膜電位水平低時，主要以單體形式存在，激發(fā)波長為527 nm，呈綠色熒光;當(dāng)JC-1濃度升高或線粒體膜電位水平較高時，形成聚合物，發(fā)出紅色的熒光，激發(fā)波長為590 nm［12］。線粒體對JC-1的攝取依賴于跨膜電位，正常的肝細(xì)胞線粒體膜電位高，呈現(xiàn)紅色熒光;細(xì)胞損傷后，線粒體膜電位下降呈現(xiàn)由紅色到綠色的熒光轉(zhuǎn)變［13］。應(yīng)用Image-Pro Plus 6. 0專業(yè)圖像分析軟件對熒光圖片進行統(tǒng)計分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10. 0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1細(xì)胞外EhCys/CySS對高脂培養(yǎng)LO2細(xì)胞ROS生成的影響

以0. 3 mmol/L油酸處理LO2細(xì)胞造肝細(xì)胞NAFLD模型。用活性氧熒光探針DCFH-DA和MitoSOX分別標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS，熒光顯微鏡下拍照，熒光酶標(biāo)儀檢測ROS強度。與C組相比，相同EhCys/CySS下，油酸使OA組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光和線粒體內(nèi)紅色熒光增強，即ROS增多;各組中氧化的細(xì)胞外狀態(tài)( 0 mV)下細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)熒光明顯增強，表明ROS增多，而還原的細(xì)胞外狀態(tài)(－150 mV)下的細(xì)胞相應(yīng)指標(biāo)均減弱，見圖1。

Figure 1.The effects of EhCys/CySS on ROS generation in the OA treated LO2 cells (×400).Mean±SD.n =6.##P＜0. 01 vs C(－150 mV) group;*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs C (－80 mV) group;△△P＜0. 01 vs C( 0 mV) group;+ +P＜0. 01 vs OA(－80 mV) group.圖1　EhCys/CySS對NAFLD肝細(xì)胞ROS生成的影響

2氧化的細(xì)胞外狀態(tài)下LO2細(xì)胞ROS的來源

既往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ROS來源主要是線粒體和NADPH氧化酶。為了了解氧化的細(xì)胞外狀態(tài)( 0 mV)作用下LO2細(xì)胞ROS的來源，實驗中使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin［14］和線粒體內(nèi)ROS清除劑MitoQ10［15］處理氧化狀態(tài)下培育的細(xì)胞。結(jié)果顯示，由氧化的EhCys/CySS增加的細(xì)胞內(nèi)ROS，在apocynin的作用下輕微地減少了，而MitoQ10使增加的ROS顯著地減少了( P＜0. 01)，見圖2。

Figure 2.The source of ROS in the LO2 cells treated with the oxidized EhCys/CySS.Mean±SD.n =6.△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs C( 0 mV) ;##P＜0. 01 vs C(－150 mV) ;＊＊P＜0. 01 vs C(－80 mV) ;+ +P＜0. 01 vs rotenone(－80 mV).圖2　氧化的EhCys/CySS作用下LO2細(xì)胞ROS的來源

3氧化的EhCys/CySS抑制線粒體復(fù)合體I活性

由上面的實驗可知，氧化的細(xì)胞外狀態(tài)下LO2細(xì)胞ROS主要來源于線粒體。為了進一步探究線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生機制，實驗針對線粒體呼吸鏈產(chǎn)生ROS的環(huán)節(jié)，選擇線粒體復(fù)合體I和III的抑制劑，rotenone( 2 μmol/L)和antimycin A( 5 μmol/L)［16］。實驗結(jié)果顯示，2種抑制劑作用后都使細(xì)胞ROS生成增加;但是antimycin A孵育細(xì)胞后，各組細(xì)胞ROS的增加率與細(xì)胞外EhCys/CySS無關(guān)，而復(fù)合體I抑制劑rotenone作用后ROS的增加率與細(xì)胞外EhCys/ CySS呈相關(guān)趨勢，即0 mV時增加了23. 5%，－150 mV時增加了151. 6%。實驗說明氧化的EhCys/ CySS可能通過抑制線粒體復(fù)合體I活性來增加ROS的生成。

使用線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性檢測試劑盒進一步驗證實驗假設(shè)。結(jié)果顯示0 mV時線粒體復(fù)合體I的活性只有正常狀態(tài)下細(xì)胞的42%，而－150 mV時細(xì)胞復(fù)合體I活性輕微增強，實驗結(jié)果進一步證明了氧化的EhCys/CySS通過抑制線粒體復(fù)合體I活性來增加ROS的生成，見圖2。

4細(xì)胞外EhCys/CySS對LO2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖3所示，與C組相比，油酸使OA組細(xì)胞線粒體膜電位下降，JC-1染色由紅色向橙色轉(zhuǎn)變，綠色熒光與紅色熒光的比值由65%增長到82% ( P＜0. 01) ;與正常生理狀態(tài)(－80 mV)相比，氧化狀態(tài)( 0 mV)使NAFLD肝細(xì)胞線粒體膜電位進一步下降，JC-1染色由橙色向綠色轉(zhuǎn)變，綠色/紅色熒光比值由82%增長到110%( P＜0. 01) ;還原狀態(tài)(－150 mV)逆轉(zhuǎn)了NAFLD肝細(xì)胞線粒體膜電位的下降，JC-1染色呈紅色，綠色/紅色熒光比值由82%降低到71%( P＜0. 05)，見圖3。

討論

與正常肝臟相比，脂肪肝肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積增加了線粒體β-氧化，ROS增多造成氧化應(yīng)激，ATP生成減少，線粒體功能紊亂。能量代謝障礙越嚴(yán)重，肝細(xì)胞對脂肪的處理轉(zhuǎn)運能力越低，肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積也越多，形成惡性循環(huán)，這在NAFLD發(fā)病機制中起重要作用［8］。Cys/CySS組成了人血漿中最主要的低分子量硫醇/二硫化物物質(zhì)對［1］，肥胖、糖尿病、化療、酗酒、抽煙等往往伴隨著血漿中EhCys/CySS的氧化［2］，越來越多研究表明氧化的EhCys/CySS與脂質(zhì)代謝性疾病的危險因素有關(guān)。Imhoff等［5］研究表明高脂飲食會導(dǎo)致小鼠血漿EhCys/CySS氧化，細(xì)胞實驗進一步說明細(xì)胞外液氧化的EhCys/CySS能加劇脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成，而還原的EhCys/CySS能改善脂質(zhì)沉積。Thong等［17］研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸能改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化應(yīng)激和肝脂質(zhì)沉積及炎癥癥狀。而且，N-乙酰半胱氨酸作為L-cysteine的前體，能使血漿中EhCys/CySS還原［18］。因此，血漿中氧化的EhCys/CySS可能對NAFLD發(fā)生發(fā)展起重要作用。

Figure 3.The effects of EhCys/CySS on the mitochondrial membrane potential of OA treated LO2 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs OA(－80mV).圖3　EhCys/CySS對LO2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

本研究通過細(xì)胞實驗，以Cys、CySS和Cys-free DMEM培養(yǎng)基模擬人體氧化、正常和還原的細(xì)胞外環(huán)境培育LO2細(xì)胞并以油酸建立NAFLD模型。研究中發(fā)現(xiàn)油酸NAFLD模型能使細(xì)胞ROS增加線粒體膜電位降低，而氧化的EhCys/CySS( 0 mV)加劇了ROS的生成并使線粒體膜電位進一步下降，還原的EhCys/CySS(－150 mV)能清除ROS并糾正降低的膜電位。線粒體ROS清除劑MitoQ10顯著減少了由氧化EhCys/CySS所增加的ROS。線粒體復(fù)合體I抑制劑rotenone作用于細(xì)胞后，ROS的增長率與細(xì)胞外EhCys/CySS有關(guān)，0 mV時ROS的增長率很小并且線粒體復(fù)合體I活性減弱。實驗說明，對于高脂培養(yǎng)的LO2肝細(xì)胞，細(xì)胞外液氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復(fù)合體I加劇肝細(xì)胞ROS的生成，并使線粒體膜電位降低，而還原的EhCys/CySS能減少高脂所致ROS生成并改善線粒體損傷。線粒體膜電位下降表明線粒體功能障礙，即可引起線粒體能量儲備減少及氧化應(yīng)激增強，導(dǎo)致脂質(zhì)變性的肝細(xì)胞對二次打擊的抵抗能力降低。

綜上，高脂飲食能使動物血漿EhCys/CySS氧化，高脂培養(yǎng)能導(dǎo)致LO2肝細(xì)胞內(nèi)ROS增多，氧化的細(xì)胞外EhCys/CySS能通過抑制線粒體復(fù)合體I加劇NAFLD肝細(xì)胞ROS的生成，并使線粒體膜電位進一步下降，而還原的EhCys/CySS能清除ROS并改善線粒體損傷。實驗根據(jù)細(xì)胞外EhCys/CySS對肝細(xì)胞線粒體功能的影響，進一步認(rèn)識高脂通過細(xì)胞外氧化還原狀態(tài)來影響細(xì)胞內(nèi)的功能，這有助于深入探究NAFLD的病理機制。關(guān)于高脂是如何氧化血漿EhCys/CySS及由此引發(fā)的氧化的EhCys/CySS對NAFLD進程的影響，如肝脂質(zhì)沉積、炎性反應(yīng)、纖維化等機制有待進一步研究。

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Extracellular cysteine/cystine redox potential affects mitochondrial function in NAFLD LO2 cells

GUAN Qing-hua，DING Qi-long
( Experimental and Teaching Center of Medical Basis for Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China.E-mail: g637cpu@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of extracellular cysteine/cystine redox potential ( EhCys/CySS) on the mitochondrial function of nonalcoholic fatty liver disease ( NAFLD) hepatocytes.METHODS: LO2 cells were incubated with EhCys/CySS of the oxidized ( 0 mV)，the normal (－80 mV)，or the reduced (－150 mV) status medium，then treated with oleic acid to establish NAFLD model in vitro.DCFH-DA and MitoSOX were used as the fluorescent probes for determining reactive oxygen species ( ROS).Apocynin ( NADPH oxidase inhibitor)，MitoQ(10)( mitochondria-targeted antioxidant)，rotenone ( mitochondrial respiratory chain complex I inhibitor) and antimycin A ( mitochondrial respiratory chain complex III inhibitor) were used to investigate the sources of ROS.RESULTS: An increase in ROS in LO2 cells by oleic acid was aggravated by the oxidized extracellular EhCys/CySS ( 0 mV)，which was removed by the reduced EhCys/ CySS (－150 mV).ROS generation by 0 mV was significantly eliminated by MitoQ(10).ROS levels were dependent on extracellular EhCys/CySS in rotenone treated LO2 cells.A decline of mitochondrial membrane potential in the cells with NAFLD was aggravated by 0 mV and reversed by－150 mV.CONCLUSION: The oxidized extracellular EhCys/CySS via inhibitiing of complex I intensifies ROS generation and reducing the mitochondrial membrane potential in the NAFLD hepatocytes，which were reversed by reduced EhCys/CySS.

［KEY WORDS］Cysteine / cystine redox potential; Reactive oxygen species; Nonalcoholic fatty liver disease; Mitochondria

通訊作者△Tel: 025-86185359; E-mail: g637cpu@163.com

［收稿日期］2015-01-06［修回日期］2015-03-26

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1266-06

［中圖分類號］R363

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.020