自噬減輕模擬缺血/再灌注微環(huán)境中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷*

張　丹，李　靜，李玉蘋，李翅翅(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，浙江溫州5000;復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海000;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，浙江溫州5000)

自噬減輕模擬缺血/再灌注微環(huán)境中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷*

張丹1，李靜2，李玉蘋1，李翅翅3△
(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，浙江溫州325000;2復(fù)旦大學(xué)
附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海200032;3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，浙江溫州325000)

［摘要］目的:觀察體外模擬缺血/再灌注( ischemia/reperfusion，I/R)微環(huán)境下人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞( human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs)的自噬變化，研究自噬在維持I/R條件下HPMVECs細(xì)胞存活及內(nèi)皮屏障完整性中的作用。方法:用雷帕霉素( rapamycin，RAP)預(yù)處理HPMVECs，在缺糖缺氧/恢復(fù)糖和氧供( oxygen-glucose deprivation/oxygen-glucose restoration，OGD)模擬的I/R微環(huán)境中孵育細(xì)胞。應(yīng)用Western blot及透射電鏡法檢測(cè)細(xì)胞自噬變化，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通透性小室法檢測(cè)HPMVECs通透性。結(jié)果: OGD條件下HPMVECs的自噬水平明顯升高，RAP預(yù)處理進(jìn)一步上調(diào)了OGD條件下的細(xì)胞自噬。OGD組細(xì)胞凋亡率明顯增高，細(xì)胞通透性增加。RAP預(yù)處理不僅降低了OGD引起的細(xì)胞凋亡率，而且減輕了OGD條件下細(xì)胞通透性。結(jié)論:自噬在I/R誘發(fā)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)性作用，提高自噬水平有助于減少I/R條件下細(xì)胞凋亡并維持內(nèi)皮屏障完整性。

［關(guān)鍵詞］肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞;自噬;缺血/再灌注;細(xì)胞凋亡;內(nèi)皮通透性

自噬是亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化并在溶酶體參與下對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體的方式不同，可將自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種類型［1］。其中巨自噬是真核細(xì)胞內(nèi)最重要的自噬形式，也是本研究的重點(diǎn)。生理狀態(tài)下細(xì)胞的自噬水平很低，但饑餓、缺血及缺氧等應(yīng)激刺激可提高細(xì)胞自噬水平［2］。研究表明，自噬有助于維持某些病理狀態(tài)下細(xì)胞的存活，阻斷自噬則加重細(xì)胞損傷［3］。缺血/再灌注誘發(fā)的肺損傷( ischemia/reperfusion induced lung injury，I/R-LI)是發(fā)生于肺移植及心臟手術(shù)中的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，主要病理變化為氣血屏障受損繼而引發(fā)肺水腫［4］，嚴(yán)重影響了患者的心肺功能。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是氣血屏障的重要組成細(xì)胞之一。研究證實(shí)，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡和肺微血管屏障完整性受損是I/R-LI過程中氣血屏障功能失調(diào)的重要原因［5］。然而，自噬與肺I/R中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡和微血管屏障完整性受損的關(guān)系及機(jī)制仍不清楚。

雷帕霉素( rapamycin，RAP)是一種臨床上廣泛使用的免疫抑制劑。同時(shí)，RAP還是一種自噬促進(jìn)劑，主要通過特異性抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin，mTOR)復(fù)合體1的功能上調(diào)細(xì)胞自噬水平［6］。眾多研究已發(fā)現(xiàn)RAP在多種疾病中發(fā)揮的細(xì)胞保護(hù)性作用源于其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)［7-8］。本研究通過用RAP預(yù)處理的方法研究了其對(duì)體外模擬I/R微環(huán)境中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)了自噬對(duì)細(xì)胞死亡及血管屏障完整性的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1細(xì)胞

原代人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞( human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs)購自Sciencell。培養(yǎng)細(xì)胞使用特制的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。將內(nèi)皮細(xì)胞接種于涂布有I型膠原的培養(yǎng)皿中，3～5 d后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%以上匯合即可進(jìn)行傳代，傳代時(shí)使用胰酶消化并按1∶2比例進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)中使用了第3～5代的細(xì)胞。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及體外缺血/再灌注微環(huán)境模擬按照文獻(xiàn)［9］所描述的缺糖缺氧/恢復(fù)糖和氧供( oxygenglucose deprivation/oxygen-glucose restoration，OGD)方法在體外模擬缺血/再灌注微環(huán)境。將HPMVECs隨機(jī)分為空白對(duì)照組( control組)、RAP單純處理組( RAP組)、單純OGD處理組( OGD組)及RAP預(yù)處理的OGD組( RAP + OGD組)。RAP + OGD組處理方法如下:將RAP按照10 nmol/L濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育4 h，然后用不含葡萄糖及胎牛血清的培養(yǎng)基更換正常培養(yǎng)基并將培養(yǎng)皿放入37℃無氧培養(yǎng)箱中。8 h后將培養(yǎng)皿取出，用正常含血清培養(yǎng)基更換無糖培養(yǎng)基并將培養(yǎng)皿置入含5% CO2的正常培養(yǎng)箱中孵育12 h。

2.2蛋白印跡法用細(xì)胞蛋白裂解液處理HPMVECs后收集細(xì)胞上清，然后行15% SDS-PAGE，使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為250 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min，加入Western blot封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60 min，再分別以兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 ( microtubule-associated protein 1-light chain 3，LC3)及兔抗p62蛋白Ⅰ抗，以標(biāo)記有辣根過氧化物酶的羊抗兔Ig為Ⅱ抗孵育PVDF膜。內(nèi)參照蛋白選用β-actin。使用Thermo的ECL試劑為底物，X光片曝光，顯色、定影。最后通過Quantity One 4.6軟件對(duì)發(fā)光條帶的灰度值進(jìn)行分析，通過比較各組LC3-II/LC3-I及p62/β-actin來了解自噬水平。

2.3透射電鏡標(biāo)本制備及自噬結(jié)構(gòu)斷面積統(tǒng)計(jì)在不同處理組的HPMVECs中加入2.5%戊二醛，在4℃條件下預(yù)固定2 h。用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。然后用1%鋨酸固定3 h，再用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。50%、70%、90%乙醇逐級(jí)脫水，各15 min。在4℃條件下，用90%乙醇和90%丙酮混合液( 1∶1)置換乙醇，再用90%丙酮置換，各15 min。然后，在室溫下用純丙酮置換3次，每次20 min。將細(xì)胞放入純丙酮和Jpurr樹脂( 2∶1)的混合液中浸透，室溫條件下放置3 h。然后，在純丙酮和Jpurr樹脂( 1∶2)的混合液中過夜。37℃條件下，在Jpurr樹脂中放置2 h。分別于37℃烘箱中過夜、45℃烘箱中放置12 h、60℃烘箱中放置24 h。首先將包埋后的細(xì)胞塊于超薄切片機(jī)上切取厚度為1.5 mm的半薄切片，將其移到涂有蛋白甘油加水滴的載玻片上，然后于37℃烘箱內(nèi)烘干。將甲苯胺藍(lán)染液( 1 g/L)滴在切片上，5 min后，用洗瓶沖洗切片上多余的染液，濾紙吸干水分，自然干燥。光學(xué)顯微鏡下觀察半薄切片確定含有細(xì)胞情況，用Reichert-ultracut E型超薄切片機(jī)作超薄切片，厚度為50～60 nm。在透射電鏡下觀察細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的自噬前體和自噬體等自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。用VLCDS圖像分析儀檢測(cè)并分析單位細(xì)胞斷面面積內(nèi)的自噬結(jié)構(gòu)數(shù)目，比較OGD各組與對(duì)照組之間的差異。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照BD生產(chǎn)的Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，將刮離培養(yǎng)皿的細(xì)胞用冰冷的PBS清洗2次，然后用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞混懸至濃度約1×109/L。將100 μL的細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至5 mL特制流式檢測(cè)玻璃管中，分別加入5 μL AnnexinV-FITC試劑及5 μL PI染料。充分混懸后置于暗室中于室溫下孵育15 min，然后加入400 μL結(jié)合緩沖液并混勻。立即將細(xì)胞懸浮液在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5細(xì)胞培養(yǎng)小室法檢測(cè)細(xì)胞通透性預(yù)先在Transwell嵌套小室(濾膜直徑為6.5 mm，濾膜孔徑為3 μm)的上室膜上涂以50 μL濃度為50 g/L的I型膠原，將小室置于通風(fēng)的超凈臺(tái)中放置過夜，然后用70%的乙醇浸泡滅菌并風(fēng)干。將200 μL密度為4. 4×1010cells/m2細(xì)胞懸液加入上室，在下室的培養(yǎng)板里加入1 mL培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，在此期間，每24 h更換1次培養(yǎng)液。預(yù)先1 h在上室細(xì)胞培養(yǎng)基中加入RAP，然后各組進(jìn)行OGD處理，在OGD開始時(shí)在上室中加入FITC標(biāo)記的葡聚糖使其終濃度為1 g/L。分別于OGD開始時(shí)和20 h時(shí)吸取100 μL下室的液體到96孔板中，用PBS以1∶5稀釋后，通過熒光酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度( A)值，用開始時(shí)的A值校正各時(shí)點(diǎn)所測(cè)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以與對(duì)照組所測(cè)值比值的百分?jǐn)?shù)表示。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，各組間的差別采用單因素方差分析進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 RAP預(yù)處理提高了OGD條件下HPMVECs的自噬水平

與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，RAP預(yù)處理增強(qiáng)了正常生長(zhǎng)細(xì)胞LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化率( P＜0.01)，降低了p62的表達(dá)水平( P＜0.01)。OGD處理組細(xì)胞的LC3-II表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加( P＜0.01)，p62的表達(dá)水平則顯著降低( P＜0.01)。與OGD處理組相比，RAP預(yù)處理增加了OGD條件下LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)換( P＜0.05)，降低了p62的表達(dá)( P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The autophagic level in oxygen-glucose deprivation/oxygen-glucose restoration ( OGD) -challenged human pulmonary microvascular endothelial cells ( HPMVECs) with rapamycin ( RAP) preconditioning.Mean±SD.n =3.##P＜0. 01 vs control group;*P＜0. 05 vs OGD group.圖1　Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平

2 RAP預(yù)處理對(duì)OGD條件下HPMVECs自噬超微結(jié)構(gòu)的影響

本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到自噬前體呈馬蹄形樣雙層膜結(jié)構(gòu)，其不完全包裹細(xì)胞質(zhì)樣物質(zhì)，自噬體呈多層膜包裹的橢圓形結(jié)構(gòu)，其包裹物為類似胞質(zhì)樣的均質(zhì)物質(zhì)。自噬溶酶體則為單層膜結(jié)構(gòu)，其中包裹有自噬體樣橢圓形結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照組相比，單純RAP處理組及OGD處理組細(xì)胞單位斷面面積內(nèi)自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著增大( P＜0. 01)，而RAP預(yù)處理繼而OGD處理組細(xì)胞中此參數(shù)較單純OGD組進(jìn)一步增高( P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Autophagic ultrastructures and statistical analysis by transmission electron microscopic observation.A: the autophagosome precursors (↑) was as crescentiform and double membrane structure; B: the autophagosome coating multi-membrane(↑) ; the contents of the autophagosome may be cytoplasm; C: the autophagolysosome was a structure with single membrane and contain an autophagosome (↑) ; D: quantitative analysis of the number of autophagosomes in different groups.Mean±SD.n =3.##P＜0. 01 vs control group;＊＊P＜0. 01 vs OGD group.圖2　自噬超微結(jié)構(gòu)圖像及統(tǒng)計(jì)分析

3 提高自噬水平改善了OGD引發(fā)的細(xì)胞死亡

如圖3所示，空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為( 4.83 ±1.13) %，單純RAP處理組細(xì)胞凋亡率約( 4.79 ±1.11) %，兩者無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。OGD組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高，達(dá)( 26.30±1.62) %，而用RAP預(yù)處理則顯著降低了OGD引發(fā)的細(xì)胞凋亡，凋亡率僅為( 14.6±1.7) %( P＜0.05)。

4 提高自噬水平對(duì)OGD條件下HPMVECs通透性的影響

對(duì)照組細(xì)胞通透性較低，我們將空白對(duì)照組細(xì)胞通透性作為基數(shù)來檢測(cè)其它處理組細(xì)胞通透性。與空白對(duì)照組相比，RAP處理組細(xì)胞通透性未發(fā)生明顯改變，而OGD處理組細(xì)胞通透性較對(duì)照組明顯升高( P＜0.01)。與OGD組相比，RAP預(yù)處理繼而OGD處理組細(xì)胞通透性顯著降低( P＜0.05)，見圖4。

討論

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了OGD條件下HPMVECs的自噬變化并研究了自噬對(duì)OGD微環(huán)境下HPMVECs凋亡及通透性等的影響。我們觀察到，與對(duì)照組相比，OGD條件下HPMVECs的自噬水平升高，細(xì)胞凋亡率及內(nèi)皮通透性均明顯升高。預(yù)先用RAP提高自噬水平后，明顯降低了OGD誘發(fā)的細(xì)胞凋亡率，并且有效改善了內(nèi)皮屏障的高通透性。本文提出，自噬不但有利于維持OGD條件下細(xì)胞存活，并且有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整性。

Figure 3.The effects of autophagy on the apoptosis of OGD-challenged HPMVECs.Mean±SD.n = 3.#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control group;*P＜0. 05 vs OGD group.圖3　自噬對(duì)OGD條件下HPMVECs凋亡的影響

Figure 4.The effect of autophagy on the permeability of HPMVECs challenged by OGD.Promoting autophagy with RAP alleviated OGD-induced high permeability in HPMVECs.Mean±SD.n = 3.#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control group;*P＜0. 05 vs OGD group.圖4　自噬對(duì)OGD條件下HPMVECs通透性的影響

多種蛋白參與了細(xì)胞自噬過程，其中，LC3是參與自噬體形成的必須蛋白，自噬體形成時(shí)，胞漿型LC3-I會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3-II，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。p62是自噬酶解底物，其表達(dá)水平與自噬水平呈負(fù)相關(guān)［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們一方面檢測(cè)了LC3及p62的表達(dá)變化，另外通過透射電鏡觀察并分析了細(xì)胞內(nèi)自噬超微結(jié)構(gòu)數(shù)量，由此來更加客觀評(píng)價(jià)不同處理組細(xì)胞的自噬水平。我們觀察到，OGD條件下，自噬水平明顯增高，RAP預(yù)處理進(jìn)一步提高了細(xì)胞在OGD條件下的自噬水平。同樣，Matsui等［11］發(fā)現(xiàn)用無糖培養(yǎng)基處理明顯上調(diào)了心肌細(xì)胞的自噬水平。Wang等［12］也觀察到缺糖缺氧處理后的神經(jīng)元細(xì)胞自噬水平明顯高于對(duì)照組。但是，過長(zhǎng)時(shí)間的缺血缺氧可損傷自噬-溶酶體途徑，大量自噬體的積聚引起心肌細(xì)胞不可逆的損傷和心肌收縮功能障礙［13］。研究認(rèn)為，在長(zhǎng)期缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子1可通過抑制自噬基因Beclin-1的表達(dá)而由此阻斷自噬體形成［14］。這些不同的研究結(jié)果反映了體外模擬的I/R微環(huán)境對(duì)細(xì)胞自噬水平發(fā)揮重要影響，不同刺激時(shí)間以及刺激方式可能對(duì)自噬發(fā)揮不同程度的影響。這些研究也提示體外模擬的I/R微環(huán)境不能完全模擬在體I/R損傷，所以無法充分說明自噬在I/ R-LI中的作用。未來的研究將重點(diǎn)靶向闡明I/R微環(huán)境下多種損傷因素對(duì)自噬的具體調(diào)節(jié)機(jī)制。

在I/R-LI中，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是主要損傷靶點(diǎn)之一。I/R過程中產(chǎn)生的超氧化物不僅引發(fā)細(xì)胞損傷而且容易誘發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死，導(dǎo)致氣血屏障受損致使肺水腫發(fā)生。我們的研究表明，適度自噬有利于維持OGD條件下的細(xì)胞存活及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性。預(yù)先用RAP提高細(xì)胞自噬水平明顯降低了OGD引發(fā)的細(xì)胞損傷及高通透性。這些結(jié)果與自噬特有的功能是相符合的。首先，自噬可以包裹受損的線粒體，由此減少了損傷線粒體內(nèi)諸如細(xì)胞色素C等一系列促凋亡因子的釋放，從而抑制了凋亡的啟動(dòng)［15］。另一方面，在饑餓等應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞可通過自噬降解自身的一些損傷細(xì)胞器或長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)，由此為其自身存活提供了新陳代謝所必需的氨基酸等小分子物質(zhì)，而且有助于維持三羧酸循環(huán)并為細(xì)胞提供ATP［16］。這些過程對(duì)于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在I/R環(huán)境下的存活及細(xì)胞間緊密連接的形成都是必不可少的。這些證據(jù)都合理解釋了適度自噬在OGD條件下內(nèi)皮細(xì)胞存活及屏障完整性維持中的作用。

綜上所述，本研究明確了自噬有助于維持肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在I/R條件下的存活，并且在維持內(nèi)皮屏障完整性中發(fā)揮保護(hù)性作用。RAP預(yù)處理上調(diào)自噬進(jìn)一步增強(qiáng)了自噬對(duì)HPMVECs的保護(hù)性作用。我們的研究為進(jìn)一步闡明I/R-LI的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并且自噬有望作為未來治療I/R-LI相關(guān)疾病的新的干預(yù)靶點(diǎn)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Cuervo AM.autophagy: in sickness and in health autophagy: in sickness and in health［J］.Trends Cell Biol，2004，14( 2) : 70-77.

［2］江立波，張小磊，徐華梓，等.細(xì)胞自噬對(duì)饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28( 7) : 1302-1307.

［3］Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion［J］.Nature，2008，451( 7182) : 1069-1075.

［4］Matthay MA，Ware LB，Zimmerman GA.The acute respiratory distress syndrome［J］.J Clin Invest，2012，122 ( 8) : 2731-2740.

［5］Ng CS，Wan S，Yim AP.Pulmonary ischaemia-reperfusion injury: role of apoptosis［J］.Eur Respir J，2005，25 ( 2) : 356-363.

［6］Yu J，Parkhitko AA，Henske EP.Mammalian target of rapamycin signaling and autophagy: roles in lymphangioleiomyomatosis therapy［J］.Proc Am Thorac Soc，2010，7 ( 1) : 48-53.

［7］Sekiguchi A，Kanno H，Ozawa H，et al.Rapamycin promotes autophagy and reduces neural tissue damage and locomotor impairment after spinal cord injury in mice［J］.J Neurotrauma，2012，29( 5) : 946-956.

［8］楊鳳杰，周建華，呂倩影，等.雷帕霉素減緩大鼠被動(dòng)Heymann腎炎的進(jìn)展［J］.中國病理生理雜志，2014，30( 9) : 1661-1665.

［9］Narasimhan P，Liu J，Song YS，et al.VEGF stimulates the ERK 1/2 signaling pathway and apoptosis in cerebral endothelial cells after ischemic conditions［J］.Stroke，2009，40 ( 4) : 1467-1473.

［10］Pankiv S，Clausen TH，Lamark T，et al.p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy［J］.J Biol Chem，2007，282( 33) : 24131-24145.

［11］Matsui Y，Takagi H，Qu X，et al.Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion: roles of AMP-activated protein kinase and beclin 1 in mediating autophagy［J］.Circ Res，2007，100( 6) : 914-922.

［12］Wang P，Guan YF，Du H，et al.Induction of autophagy contributes to the neuroprotection of nicotinamide phosphoribosyltransferase in cerebral ischemia［J］.Autophagy，2012，8( 1) : 77-87.

［13］Decker RS，Wildenthal K.Lysosomal alterations in hypoxic and reoxygenated hearts.I.Ultrastructural and cytochemical changes［J］.Am J Pathol，1980，98( 2) : 425-444.

［14］Bohensky J，Shapiro IM，Leshinsky S，et al.HIF-1 regulation of chondrocyte apoptosis induction of the autophagic pathway［J］.Autophagy，2007，3( 3) : 207-214.

［15］Kim I，Lemasters JJ.Mitochondrial degradation by autophagy ( mitophagy) in GFP-LC3 transgenic hepatocytes during nutrient deprivation［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300( 2) : C308-C317.

［16］Lum JJ，DeBerardinis RJ，Thompson CB.Autophagy in metazoans: cell survival in the land of plenty［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6( 6) : 439-448.

Autophagy attenuates injury of human pulmonary microvascular endothelial cells under mimic ischemia/reperfusion microenvironment

ZHANG Dan1，LI Jing2，LI Yu-ping1，LI Chi-chi3
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;2Department of Respiratory Medicine，Zhongshan Hospital Fudan University，Shanghai 200032，China;3Department of Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，Chin.E-mail: lichichi2008@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To detect the autophagic changes of human pulmonary microvascular endothelial cells ( HPMVECs) under ischemia/reperfusion ( I/R) microenvironment，and to clarify the effects of autophagy on the HPMVECs survival and endothelial barrier integrity under I/R condition.METHODS: Rapamycin ( RAP) was applied to promote autophagy of HPMVECs.These cells were then incubated under the condition of oxygen-glucose deprivation/oxygenglucose restoration ( OGD).After exposure to OGD，the changes of autophagy，cellular death and permeability of the cells were determined by transmission electron microscopy，flow cytometry and transwell assay，respectively.RESULTS: Compared with the control cells，OGD-challenged cells had a much higher level of autophagy.The apoptotic rate was much higher and endothelial permeability was more serious in OGD group than those in control group.Preconditioning with RAP effectively improved OGD induced autophagy，it did not affect the cell survival and endothelial permeability under normal living condition，but obviously decreased the cells apoptotic rate，and remarkably lowered OGD-induced high permeability of the cells.CONCLUSION: Autophagy protects HPMVECs against I/R-induced injury.Promotion of autophagy is helpful for attenuating I/R-induced cell death and sustaining the endothelial barrier integrity.

［KEY WORDS］Pulmonary microvascular endothelial cells; Autophagy; Ischemia/reperfusion; Apoptosis; Endothelial permeability

通訊作者△Tel: 0577-88069280; E-mail: lichichi2008@163.com

*［基金項(xiàng)目］浙江省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目( No.LQ15H150002)

［收稿日期］2014-12-25［修回日期］2015-05-05

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1253-06

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.018