加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝及肝細(xì)胞形態(tài)的影響

謝雪姣，徐 佳，李亞梅，吳若霞，廖端芳，陳聰伶，尹棟梁

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208）

加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝及肝細(xì)胞形態(tài)的影響

謝雪姣，徐 佳，李亞梅，吳若霞，廖端芳，陳聰伶，尹棟梁

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208）

目的觀察加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血脂的影響。方法 44只ApoE-/-小鼠以高脂飼喂養(yǎng)4周構(gòu)建AS小鼠模型，分別用辛伐他汀、加味二陳湯對(duì)小鼠灌胃給藥，8周后處死小鼠，酶法檢測(cè)血清血脂；每周稱(chēng)取并記錄小鼠體重；油紅O染色觀察小鼠主動(dòng)脈管腔內(nèi)粥樣斑塊；HE染色觀察小鼠主動(dòng)脈管腔內(nèi)粥樣斑塊沉積及肝細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 加味二陳湯可顯著降低小鼠血清中TCHOL、LDL-C水平（P＜0.01）；各組小鼠體重均有所增加，但模型組小鼠體重略高于空白對(duì)照組和加味二陳湯組；油紅O染色結(jié)果顯示加味二陳湯可顯著減少ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈管腔內(nèi)粥樣斑塊的面積；小鼠主動(dòng)脈HE染色示加味二陳湯組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)有脂質(zhì)沉積斑塊較模型組明顯減少；肝細(xì)胞切片HE染色發(fā)現(xiàn)加味二陳湯組小鼠肝細(xì)胞的病變程度較輕，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰。結(jié)論 加味二陳湯能有效降低ApoE-/-小鼠血清中有關(guān)脂質(zhì)的含量，調(diào)節(jié)小鼠脂質(zhì)代謝，緩解動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

加味二陳湯；動(dòng)脈粥樣硬化；血脂；HE染色

二陳湯始見(jiàn)于宋·《太平惠民和劑局方·卷四》，方用半夏（湯洗7次）、橘紅各五兩、白茯苓三兩、甘草（炙）一兩半，生姜七片，烏梅1個(gè)。主治“痰飲為患，或嘔吐惡心，或頭眩心悸，或中脘不快，或發(fā)為寒熱，或因食生冷，脾胃不和”?，F(xiàn)代二陳湯多用于代謝性疾病、肺系疾病、心血管疾病等［1-3］。本研究旨在探索加味二陳湯（陳皮、茯苓、半夏、甘草、荷葉、山楂、刺五加）對(duì)ApoE-/-小鼠血脂的影響，為其治療動(dòng)脈粥樣硬化提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7～8周齡雄性ApoE-/-基因敲除小鼠44只，體重（19～21）g，品系為C57BL/6J，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心從美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)【SCXK（京）2011-0012】，繁育動(dòng)物飼養(yǎng)及無(wú)菌手術(shù)均在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行，使用許可證號(hào)【SYXK（湘）：2013-0005】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及飼料：茯苓15 g、陳皮10 g、法半夏10 g、甘草6 g、荷葉10 g、山楂15 g、刺五加10 g加水煎煮30 min后趁熱過(guò)濾，濃縮至生藥0.5 g生藥/mL，制得煎液。高脂飼料（膽固醇1％，豬油5％，普通飼料94％）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工制作。小鼠用墊料購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將44只ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取小鼠12只，普通飼料喂養(yǎng)，作為空白對(duì)照組；其余32只，高脂飼料喂養(yǎng)，予自由飲水。4周后，隨機(jī)抽取小鼠4只（空白對(duì)照組2只，模型組2只），檢測(cè)小鼠血脂，對(duì)小鼠心臟主動(dòng)脈和主動(dòng)脈瓣行油紅O染色，證實(shí)AS模型已制備成功。按小鼠體重，采用隨機(jī)區(qū)組方法將動(dòng)物分為3組，模型組（n=10），辛伐他汀組（n=10），加味二陳湯組（n=10）。

空白對(duì)照組與模型組小鼠均給予同用藥組等體積的生理鹽水灌胃，辛伐他汀組小鼠給予辛伐他汀3 mg/（Kg·d）［4］灌胃，加味二陳湯小鼠給予其浸膏按生藥量2.2 g/Kg·d）灌胃。灌胃體積均為20 mL/Kg·d），配制藥液的溶劑均為生理鹽水。各組動(dòng)物灌胃8周后，禁食不禁水12 h，經(jīng)眼眶靜脈叢取血，備用。用4％多聚甲醛溶液從小鼠左心室灌流30 min后，剝離主動(dòng)脈后，常溫保存在4％多聚甲醛溶液中，備用。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

應(yīng)用全自動(dòng)生化儀，檢測(cè)總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。剝離的主動(dòng)脈行油紅O染色，觀察主動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)染色情況，HE染色觀察主動(dòng)脈瓣脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞形態(tài)，雙目顯微鏡采集圖片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血清血脂水平的影響

由表1可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型組血清TG、TCHOL、HDL-C、LDL-C均明顯升高（P＜0.01），表明模型組出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂。與模型組相比，辛伐他汀組血清 TG、TCHOL、LDL-C均降低（P＜0.01）；加味二陳湯組血清TCHOL、LDL-C均明顯降低（P＜0.05）。說(shuō)明加味二陳湯同辛伐他汀一樣，具有明顯的降脂功效。

表1 加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血脂水平的影響（n=8，±s，mmoL/mL）Tab.1 Effects of modified Erchen decoction on serum lipid level in the ApoE-/-mice（n=8，±s，mmoL/mL）

表1 加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血脂水平的影響（n=8，±s，mmoL/mL）Tab.1 Effects of modified Erchen decoction on serum lipid level in the ApoE-/-mice（n=8，±s，mmoL/mL）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；Compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別Groups劑量Dose甘油三酯TG總膽固醇TCHDL高密度脂蛋白HDL-C低密度脂蛋白LDL-C空白組Normal 0.2 mL/Kg·d 0.48±0.09## 8.18±1.01## 3.76±0.44## 5.45±0.87##模型組Model 0.2 mL/Kg·d 0.74±0.22＊＊ 10.97±0.78＊＊ 4.96±0.66＊＊ 7.35±0.91＊＊辛伐他汀組Simvastatin 3 mg/Kg·d 0.58±0.17 8.16±0.84## 3.85±0.46## 5.58±0.85##加味二陳湯Modified Erchen decoction 1.16 mg/Kg-·d 0.72±0.23＊＊ 9.26±1.07*## 4.22±0.66## 6.27±0.83#

2.2 加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積斑塊的影響

油紅O能特異性結(jié)合脂質(zhì)而產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的紅色，對(duì)小鼠主動(dòng)脈行油紅O大體染色，能對(duì)整條主動(dòng)脈做全局觀察。由圖1可知，模型組小鼠主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈干管腔內(nèi)均可見(jiàn)大量脂質(zhì)堆積，而辛伐他汀、加味二陳湯組小鼠主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈干管腔內(nèi)脂質(zhì)沉積斑塊均明顯少于模型組（圖1見(jiàn)文后彩插3）。

2.3 加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈管腔內(nèi)斑塊沉積的影響

對(duì)小鼠主動(dòng)脈行HE染色，觀察主動(dòng)脈管腔內(nèi)脂質(zhì)斑塊沉積，結(jié)果如圖2所示（圖2見(jiàn)文后彩插3）。對(duì)小鼠的主動(dòng)脈石蠟切片行HE染色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、結(jié)締組織等呈不同程度的紅色，結(jié)果如圖2所示，空白對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜完整、光滑，未見(jiàn)明顯增厚的現(xiàn)象，無(wú)泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)可見(jiàn)大量脂質(zhì)堆積形成的斑塊，且有斑塊破裂增生的跡象，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；辛伐他汀組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜有增厚跡象，但沒(méi)有明顯的斑塊形成；加味二陳湯組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)有脂質(zhì)沉積斑塊形成，但與模型組相比，斑塊明顯減少，且未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4 加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響

對(duì)小鼠肝臟切片行HE染色，觀察肝臟形態(tài)，結(jié)果如圖3所示（圖3見(jiàn)彩插）。在光學(xué)顯微鏡下顯示空白對(duì)照組小鼠的肝細(xì)胞大小較正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，肝細(xì)胞內(nèi)僅未見(jiàn)明顯的空泡。模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，肝細(xì)胞脂肪變性明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，辛伐他他汀組小鼠肝細(xì)胞的病變程度明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)趨于正常，細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡和脂變細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞腫脹程度也有所減輕。與糢型組相比，加味二陳湯組小鼠肝細(xì)胞的病變程度明顯減輕，細(xì)胞內(nèi)的脂肪空泡少于模型組，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰。

3 討論

二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，因方中半夏、橘紅以陳久者良而命名為“二陳”，為祛痰的通用方劑。加味二陳湯乃二陳湯去烏梅、生姜，加荷葉、山楂、刺五加組成，方中以法夏為君，取其辛溫性燥，善能燥濕化痰，且又降逆和胃；以陳皮為臣，理氣燥濕祛痰，燥濕以助半夏化痰之力，理氣可使氣順則痰消；痰由濕生，濕自脾來(lái)，故佐以茯苓健脾滲濕，使?jié)袢テ⑼?，痰無(wú)由生；去掉降逆之生姜、酸收之烏梅，加自古奉為瘦身的良藥荷葉加以山楂健脾消食，化滯消積；刺五加益氣健脾；荷葉健脾升陽(yáng)，消暑利濕，共助痰濕從下而解且不傷脾陽(yáng)；以甘草為使藥，調(diào)和藥性而兼潤(rùn)肺和中。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，燥濕化痰，行氣消脂，活血通脈。筆者臨床將其辨證論治用之于單純性肥胖、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等疾病，屢收奇效。

實(shí)驗(yàn)研究表明二陳湯能顯著降低高脂飲食大鼠的血脂水平，改善胰島素抵抗，并減輕其體重［4］。張晗等［5］通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)二陳湯合大柴胡湯能明顯改善代謝綜合征患者的高血糖、高血脂、高血壓和肥胖等癥狀。李剛等［6］發(fā)現(xiàn)山楂黃酮類(lèi)中的表兒茶素、多酚類(lèi)縮合黃烷聚合物及有機(jī)酸中的總?cè)扑岬炔伙柡退崾墙笛幕钚猿煞?。荷葉有較好的調(diào)節(jié)血脂功效，其主要活性組分是生物堿和黃酮類(lèi)化合物。且實(shí)驗(yàn)證明荷葉煎劑可有效降低TC、TG、LDL-C水平，并能改善血液粘稠度［7］；睢大員等［8］通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刺五加葉皂苷（ASS）可能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂代謝提高PGIz/TXAz比值及糾正自由基代謝紊亂，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

本研究結(jié)果也表明加味二陳湯組血清TCHOL、LDL-C均明顯降低（P＜0.05）；小鼠主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈干管腔內(nèi)脂質(zhì)沉積斑塊均明顯少于模型組；小鼠主動(dòng)脈內(nèi)有脂質(zhì)沉積斑塊形成，但與模型組相比，斑塊明顯減少，且未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與糢型組相比，小鼠肝細(xì)胞的病變程度明顯減輕，細(xì)胞內(nèi)的脂肪空泡少于模型組，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰。初步證明加味二陳湯對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂有較好的調(diào)節(jié)效果，可顯著降低ApoE-/-小鼠TCHOL、LDL-C水平，減少ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈管腔內(nèi)粥樣斑塊的面積，為臨床使用加味二陳湯治療動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病提供了依據(jù)［9］，同時(shí)也為加味二陳湯的組方提供科學(xué)依據(jù)。

［1］楊超.二陳湯加減治療慢性咳嗽120例臨床觀察［J］.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2014，12：2082-2083..

［2］吳同玉，林山，鄭良普.二陳湯對(duì)高脂飲食Wistar大鼠體重及其血脂代謝的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（11）：1218-1238.

［3］李文生.二陳湯加味治療非酒精性脂肪肝29例臨床觀察［J］.湖南中醫(yī)雜志，2014，01：44-45

［4］丁珊珊，康潔，張凌媛，等.二陳湯對(duì)高脂飲食大鼠血脂及胰島素抵抗的影響［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（15）：22 -24.

［5］張晗，劉金苓.痰濕瘀論治代謝綜合征的臨床研究［J］.中外醫(yī)療，2014（6）：131-133.

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［7］周健鵬.荷葉化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.天津藥學(xué)，2014，26（2）：65-68.

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［9］薛欣，李海玉，李玉梅，張立石.從痰論治脂肪肝機(jī)制探討［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，11：1472-1475.

Effects of the Chinese medicine，modified Erchen decoction，on the lipid metabolism and hepatocyte morphology in ApoE-/-mice

XIE Xue-jiao，XU Jia，LI Ya-mei，WU Ruo-xia，LIAO Duan-fang，CHENG Cong-ling，YIN Dong-liang
（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Objective To explore the effects of the Chinese medicine，modified Erchen decoction，on the serum lipid spectrum of ApoE-/-mice，and to explore its possible anti-atherosclerotic mechanism.Methods Forty-four male 7 -8-week old ApoE-/-mice were used in this experiment.ApoE-/-mouse models of atherosclerosis were generated by high-cholesterol diet for 4 weeks.And then，they were given simvastatin or modified Erchen decoction by gavage.The body weight of mice was recorded every week，The mice were sacrificed after treated with the drugs for 8 weeks continuously，and the plasma lipid was determined by enzymatic method.The aortic valves and arches were stained with oil red O to depict atherosclerotic plaques and liver structural changes of the mice were examined by pathology.Results Modified Erchen decoction lowered plasma lipid（including TCHOL and LDL-C）significantly（P＜0.01）.The body weight wasincreased in the mice of all groups，but it was more pronounced in the mice of model group than in the blank and modified Erchen decoction groups.The serum CHOL and LDL-C levels were significantly lowered in the modified Erchen decoction group（P＜0.01）.The area of atherosclerotic plaques in the aortic wall was significantly reduced in the mice of modified Erchen decoction group as shown by oil red O staining.The pathological changes of hepatocytes were less severe and the structure of hepatic lobules was better preserved in the mice of modified Erchen decoction group.Conclusions The Chinese medicin modified Erchen decoction can effectively reduce serum lipids，regulate lipid metabolism，and ameliorate the process of atherosclerosis in ApoE-/-mice.

Modified Erchen decoction；Atherosclerosis；Serum lipid；Aorta；Pathology；ApoE-/-mice

R33

A

1671-7856（2015）04-0044-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.009

全國(guó)第五批老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承項(xiàng)目，湖南省教育廳科研青年項(xiàng)目（編號(hào)11B092）；2011湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)481）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)201236）；湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地資助。

謝雪姣，女，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，全國(guó)第五批老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承人，主要從事心腦血管疾病中醫(yī)藥防治研究與中醫(yī)人才培養(yǎng)研究，E-mail：99511298@qq.com。

廖端芳，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究，E-mail：dfliao66@aliyun.com。

2015-02-15