大鼠羊膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)

曲春輝，張 玲，武 杰，巨榮凱，朱 華，黃 瀾，徐艷峰，白 琳，秦 川

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病理室，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

大鼠羊膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)

曲春輝，張 玲，武 杰，巨榮凱，朱 華，黃 瀾，徐艷峰，白 琳，秦 川

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病理室，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的分離并鑒定大鼠羊膜細(xì)胞，探索羊膜細(xì)胞分化潛能，為干細(xì)胞移植治療探尋新的細(xì)胞來(lái)源。方法 機(jī)械分離羊膜組織并采用0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化，應(yīng)用高糖-DMEM培養(yǎng)基（添加10 μg/L人表皮生長(zhǎng)因子）培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記物。結(jié)果 大鼠羊膜組織可分離并培養(yǎng)，細(xì)胞呈梭型，貼壁生長(zhǎng)，短期內(nèi)可以穩(wěn)定增殖。細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor，Oct-4）和性別決定區(qū)Y框蛋白（sex determining region Y box 2，Sox-2），間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物vimentin，胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物階段特異性胚胎表面標(biāo)記物（stage specific embryonic antigen-4，SSEA-4），并表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志物nestin，可表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）。結(jié)論 大鼠羊膜細(xì)胞可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物，并有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，為大鼠羊膜細(xì)胞的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

羊膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)；間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物；神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；大鼠

羊膜位于胎盤絨毛膜內(nèi)側(cè)，是一層無(wú)血管、神經(jīng)、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到對(duì)胎兒的保護(hù)作用，與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密。人源羊膜細(xì)胞在受精后第8天開(kāi)始形成，具有多項(xiàng)分化的潛能，可向三個(gè)胚層細(xì)胞進(jìn)行分化，近年來(lái)研究表明，羊膜上皮細(xì)胞能夠分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞，并合成釋放多巴胺、乙酰膽堿、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)［1］。人羊膜細(xì)胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，細(xì)胞移植后不會(huì)發(fā)生急性排斥反應(yīng)［2］。本實(shí)驗(yàn)從大鼠羊膜分離獲取羊膜細(xì)胞，建立穩(wěn)定培養(yǎng)的條件，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了探討，為其將來(lái)在細(xì)胞移植治療方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法：

1.1 材料

1.1.1 主要儀器：CO2培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基（Dulbecco‘s modified Eagle’s medium，DMEM）、人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、0.25％含EDTA的胰蛋白酶（0.25％trysin-EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、抗生素（penicillin，streptomycin）、PBS緩沖液購(gòu)自于Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90購(gòu)自與Abcam公司。CD29、CD44購(gòu)自于eBioscience公司、CD45、CD11b購(gòu)自于BD公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)孕18～18.5 d的SD大鼠，購(gòu)自中國(guó)軍科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：［SCXK-（軍）2014-0004］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用批準(zhǔn)號(hào)：ILAS-PL-2014-001。在無(wú)菌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作分離羊膜組織。

1.2 方法

1.2.1 羊膜細(xì)胞分離及培養(yǎng)：SD孕鼠腹腔注射1 ％戊巴比妥鈉（0.01 mL/g），麻醉后，無(wú)菌條件下開(kāi)腹，機(jī)械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL雙抗的PBS溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，無(wú)菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入0.25％含EDTA的胰蛋白酶10 mL，37℃，5％CO2條件下消化20～30 min。用含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，含10％FBS、10 μg/LEGF和500 U/mL雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天細(xì)胞換液，2～3 d后細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶85％～90％時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：取培養(yǎng)2～4代細(xì)胞，用0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化，含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)將其稀釋成1×106個(gè)，每個(gè)流式管1 mL細(xì)胞懸液。每流式管加2 mL PBS使細(xì)胞混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)加2 mL PBS重懸細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加50 μL PBS重懸細(xì)胞，加抗體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育30 min。每管加2 mL PBS重懸細(xì)胞2000 r/min離心5 min，棄上清液。各管加300 μL PBS重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光細(xì)胞染色：取2～4代細(xì)胞，0.25％含EDTA胰蛋白酶消化，含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。加入完全培養(yǎng)基重懸，至24孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至70％作用時(shí)，PBS沖洗，4％多聚甲醛（預(yù)冷）固定10 min。PBS沖洗2次，每次5 mim。1％Tuiton-100×孵育10 min。PBS沖洗2次，每次5 mim。山羊血清工作液每孔100 μL室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體Oct-4（1∶200）、Sox-2（1∶200）、SSEA-4（1∶200）、nestin（1∶100）、vimentin（1∶100），每孔100 μL，4℃過(guò)夜孵育。PBS沖洗3次，每次5 min。避光條件下，PBS稀釋 FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶200），37℃避光孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAPI封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 分離細(xì)胞培養(yǎng)

分離培養(yǎng)大鼠羊膜細(xì)胞，鏡下，細(xì)胞呈變形蟲(chóng)樣生長(zhǎng)（圖1a），生長(zhǎng)速度快（圖1b），需隔天換液傳代。本實(shí)驗(yàn)中大鼠羊膜細(xì)胞可傳至6～7代。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原結(jié)果

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠羊膜細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44分別為97.6％和95.8％。細(xì)胞表面抗原CD90、CD45幾乎不表達(dá)，CD11b有少量表達(dá)（圖2見(jiàn)文后彩插6）。

2.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4和Sox-2（如圖3），神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物 nestin和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物vimentin（如圖4），（圖3～4見(jiàn)文后彩插7）并表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物SSEA-4（如圖5）。可表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和NGF（如圖6）（圖5～6見(jiàn)文后彩插8）。

3 討論

通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物Oct-4和Sox-2，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物vimentin和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物nestin，表達(dá)SSEA-4?？杀磉_(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子標(biāo)記物BDNF和NGF，這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是神經(jīng)元生長(zhǎng)與存活所必需的蛋白質(zhì)分子［3］。羊膜細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD29和CD44，其表達(dá)量均在95％以上，CD45、CD90幾乎不表達(dá)，CD11-b有少量表達(dá)。

Oct-4可參與胚胎干細(xì)胞的自我更新［4，5］，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多分化潛能［6］。有研究指出Oct-4在羊膜細(xì)胞核內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)均可表達(dá)［7］。Miki等人研究結(jié)果表明人羊膜上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞都可表達(dá)Sox-2、Oct-4等干細(xì)胞標(biāo)志物［1］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在大鼠羊膜細(xì)胞中Oct-4在胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。

Nestin被認(rèn)為是在胚胎和成體組織中的多能性神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物［8-10］。在有絲分裂活躍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，現(xiàn)作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用［11］。人羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化，可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并表達(dá)nestin、Oct-4和Sox-2［12］。Vimentin起到維持細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)完整性和穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在妊娠15 d的大鼠胚胎中檢測(cè)有nestin和vimentin的表達(dá)，人羊膜細(xì)胞未分化的前體細(xì)胞中也存在 nestin、vimentin表達(dá)［13，14］。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞和人羊膜細(xì)胞中都表達(dá)nestin和vimentin因子［15-19］。SSEA-4被認(rèn)為是特異性人胚胎干細(xì)胞和卵泡期胚胎早期卵裂的標(biāo)記物，也被視為成體間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物［20］。Ilancheran等與他的同事MIKI等分別通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA-4［1，21］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)出大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)nestin、vimentin和SSEA-4。

圖1 分離并培養(yǎng)大鼠羊膜細(xì)胞，細(xì)胞呈變形蟲(chóng)樣生長(zhǎng)（標(biāo)尺=100 μm）。Note.（a）Rat amniotic cells cultured for 2 days，（b）Rat amniotic cells cultured for 3 days.Fig.1 Ameboid-shaped rat amniotic cells can be seen at 2 days（a）and 3 days（b）after isolation and culture.（Scale bar=100 μm）

NGF和BDNF都是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中成員。NGF同時(shí)也是一種信號(hào)分子［22］，缺乏NGF對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用，神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)凋亡［23］。BDNF可促進(jìn)神經(jīng)元的存活并能支持神經(jīng)元和突觸的生長(zhǎng)和分化［3］。BDNF可減少突觸喪失、矯正部分異?；虮磉_(dá)、阻止神經(jīng)元萎縮且改善與年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙，提高學(xué)習(xí)記憶能力［24，25］。研究人員發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞可合成釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF和NT-3，其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)后檢測(cè)沒(méi)有表達(dá)［2，12，26，27］。多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)移植人羊膜細(xì)胞到損傷部位能修復(fù)受損傷的神經(jīng)元，BDNF的表達(dá)水平同時(shí)增加［28-30］，說(shuō)明人羊膜細(xì)胞很可能通過(guò)釋放BDNF來(lái)修復(fù)損傷神經(jīng)元的功能。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法也發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和NGF。

人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD44、CD73、CD90、CD166和CD105，不表達(dá)骨髓造血標(biāo)記物CD34和CD45、單核細(xì)胞標(biāo)記物CD114和巨噬細(xì)胞標(biāo)記物 CD11b［1，31，32］。Murphy等在研究人羊膜上皮細(xì)胞特點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)上皮粘附分子EpCAM，幾乎不表達(dá)CD90和CD105［33］。而人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá) CD90、CD73和CD105，其表達(dá)量都在95％以上，CD45、CD34表達(dá)量少于2％［34］。Bailo等發(fā)現(xiàn)人羊膜細(xì)胞表達(dá)CD105、CD73、CD90和CD29，不表達(dá)CD34、CD45、CD14和CD3［18］。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)到大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)CD29和CD44，不表達(dá)CD90、CD45，少量表達(dá)CD11b。

羊膜細(xì)胞易于分離培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，免疫原性低，并有向三個(gè)胚層分化的潛能，在相關(guān)疾病的治療中具有很好的前景。本實(shí)驗(yàn)較為系統(tǒng)地檢測(cè)了大鼠羊膜細(xì)胞的四類干細(xì)胞標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞可表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物Oct-4和Sox-2、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物SSEA-4、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物vimentin和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin，并同時(shí)還表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF和NGF。由此，我們推測(cè)大鼠羊膜細(xì)胞很可能具有某些間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特性，為相關(guān)基礎(chǔ)研究和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一些線索。

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Isolation，culture and identification of rat amniotic cells in vitro and their expression of stem cell markers

QU Chun-hui，ZHANG Ling，WU Jie，JU Rong-kai，ZHU Hua，HUANG Lan，XU Yang-feng，BAI Lin，QIN Chuan
（Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College（PUMC）；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）；Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Disease Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

Objective To isolate and identify the rat amniotic cells and to explore their stem cell characteristics，so as to find a new cell source for stem cell transplantation.Methods Rat amnion tissue was mechanically separated from 18-18.5-day old SPF pregnant rats and 0.25％trysin-EDTA digestion was used to obtain amniotic cells.The isolated cells were cultured with DMEM D-glucose added with 10 μg/L EGF.Flow cytometry was used to detect the mesenchyme stem cellsurface markers.Neural stem cell surface markers of the rat amniotic cells were detected using immunofluorescence staining.Results The rat amniotic membrane tissue was separated and mesenchymal stem cells were cultured successfully.The cells were ameboid-shaped and showed adherent growth，and can stably proliferate in short term.Afterculture，the cells expressed stem cell markers e.g.Oct-4 and Sox-2，mesenchymal stem cell markers e.g.vimentin，embryonic stem cell markers e.g.SSEA-4，neural stem cell marker e.g.nestin，and could also express neurotrophic factors，such as BDNF and NGF.Conclusions Rat amniotic cells express mesenchymal stem cells markers，neural stem cell markers and neurotrophic factors，therefore，provide an experiment basis for further research and application of rat amniotic cells in stem cell transplantation.

Amniotic cells；Culture in vitro；Mesenchymal stem cells，marker；Neural stem cell，marker；Neutrophic factor；Rat

R33

A

1671-7856（2015）04-0061-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.012

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）課題實(shí)施方案SS2012AA022613。

曲春輝，女，碩士研究生，E-mail：quchunhui626@163.com。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：qinchuan@pumc.edu.cn。

2015-02-02

技術(shù)方法