miRNA-411對乳癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

房建凱，陳枉枉，郭玲玲

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部,江蘇 蘇州 215213 1 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室； 2 解剖學(xué)教研室暨細(xì)胞神經(jīng)生物學(xué)研究室)

?

miRNA-411對乳癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

房建凱1，陳枉枉2，郭玲玲1

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部,江蘇 蘇州 215213 1 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室； 2 解剖學(xué)教研室暨細(xì)胞神經(jīng)生物學(xué)研究室)

目的 探討微小RNA-411(miRNA-411)對人乳癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖、侵襲和遷移的影響。方法 采用實時定量PCR方法檢測高轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞MDA-MB-231與低轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞MCF-7中miRNA-411的表達(dá)。采用LipofectamineTM2000將miRNA-411成熟子(Mimic)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，通過采用實時定量PCR方法檢測miRNA-411 Mimic的轉(zhuǎn)染效率，Transwell法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力,免疫蛋白印跡法檢測E-鈣黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)，MTT實驗檢測MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果miRNA-411在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于MCF-7細(xì)胞(t=7.45,P<0.01)。miRNA-411 Mimic瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，其遷移和侵襲能力均受到明顯的抑制(t=7.24、6.62,P<0.01)，而且經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞E-cadherin表達(dá)升高，而Vimentin表達(dá)下降。然而，miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力無明顯影響(P>0.05)。結(jié)論 miRNA-411在高轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞中低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miRNA-411 Mimic后乳癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移和侵襲能力明顯減弱，其遷移和侵襲能力的下降并非通過降低MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力所致，而是可能通過逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程實現(xiàn)的。

乳房腫瘤；MDA-MB-231；miRNA-411；細(xì)胞運動；腫瘤侵潤

乳癌是一種常見的惡性腫瘤，目前已位于女性惡性腫瘤首位，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，而腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳癌病人死亡的首要原因[1]。業(yè)已證實，微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)(3-UTR)互補(bǔ)，破壞目標(biāo)特異性基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)變[2-3]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步，其機(jī)制是細(xì)胞間黏附能力的逐漸喪失和細(xì)胞遷移能力的逐漸增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，在EMT 過程中腫瘤細(xì)胞表型會發(fā)生變化，上皮細(xì)胞特性消失，而出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特性，同時其遷移和運動能力增強(qiáng)[4]。有文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，相比正常腺體組織，miRNA-411在乳癌組織中表達(dá)水平下降[5]。有關(guān)miRNA-411對乳癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究尚少。本課題旨在研究miRNA-411在低轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞中表達(dá)水平的差異，并通過進(jìn)一步的體外實驗探討miRNA-411對乳癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與培養(yǎng)

人乳癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，使用含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基購自美國Hlyclone公司，細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自北京天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自美國Thermo公司，Real-time PCR試劑盒購自美國羅氏公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM培養(yǎng)基、miRNA-411成熟子(Mimic)以及Scrambled Mimic均產(chǎn)自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國Corning公司，E-cadherin抗體和Vimentin抗體均購自Abcam公司。

1.3Real-time PCR 方法檢測miRNA-411表達(dá)

分別提取MDA-MB-231和MCF-7兩種乳癌細(xì)胞的總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用cDNA對miRNA-411表達(dá)量進(jìn)行Real-time PCR檢測，其中miRNA-411的上游引物序列為5′-GGGGGGTAGTAGACGACCGTATAG-3′，下游引物序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′(康成公司合成)。以cDNA為模版，U6為內(nèi)參照，按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)說明書進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s、60 ℃退火與延伸60 s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct值表示miRNA-411的相對表達(dá)量。

1.4miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞

將miRNA-411 Mimic(序列為UAGUAGACCGUAUAGCGUACG)、Scrambled Mimic(序列為CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，該序列為無義序列)粉末離心后，采用ddH2O將其溶解配制成濃度為20 μmol/L的溶液。轉(zhuǎn)染前1 d鋪6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將稀釋后的miRNA-411 Mimic和LipofectamineTM2000混合，室溫孵育20 min。將混合液加入6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取總RNA進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，測量miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組和Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組的miRNA-411的表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞遷移實驗檢測miRNA-411 Mimic對于MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組、Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組和未轉(zhuǎn)染實驗組(Mock組)，將MDA-MB-231細(xì)胞消化離心，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至108/L。取200 μL該細(xì)胞懸液加入小室中，在下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，以40 g/L的多聚甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色后，取100 μm邊長等面積計算細(xì)胞數(shù)量。

1.6細(xì)胞侵襲實驗檢測miRNA-411 Mimic對于MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲能力的影響

實驗前1 d將基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1∶5比例鋪于小室中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育過夜。然后，將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組、Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組和未轉(zhuǎn)染實驗組，將MDA-MB-231細(xì)胞消化離心，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至108/L。取200 μL該細(xì)胞懸液加入小室中，在下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，以40 g/L的多聚甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下計數(shù)不同視野下細(xì)胞數(shù)目。

1.7Western blotting檢測miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231 EMT過程的影響

將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組、Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組和未轉(zhuǎn)染實驗組，在6孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，然后測定E-鈣黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)水平。

1.8MTT方法檢測miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組、Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組和未轉(zhuǎn)染實驗組，每組設(shè)置5個復(fù)孔。然后于96孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，待72 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀測定在波長570 nm處光密度(OD)值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1miRNA-411在兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平

miRNA-411在高轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)水平為0.09±0.01，而低轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞MCF-7的表達(dá)水平為1.00±0.07，兩者比較差異有顯著性(t=7.45，P<0.01)。

2.2miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞對miRNA-411表達(dá)量的影響

本文利用LipofectamineTM2000將miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的miRNA-411表達(dá)量進(jìn)行定量測定。結(jié)果表明，Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組表達(dá)水平為1.00±0.07，miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組表達(dá)水平為61.01±5.04，兩者比較差異有顯著意義(t=5.74，P<0.01)。

2.3miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響

細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示，miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組細(xì)胞遷出數(shù)量為23.73±2.21，Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組為71.02±4.51，兩者比較差異有顯著性(t=7.24，P<0.01)。但Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組細(xì)胞遷出數(shù)量為71.02±4.51，未轉(zhuǎn)染實驗組為76.05±5.43，兩組相比較差異無顯著意義(P>0.05)。細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示，miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染實驗組細(xì)胞降解基質(zhì)膠并且遷出的數(shù)量為23.92±3.52，Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組為67.68±5.28，兩者比較差異有顯著意義(t=6.62，P<0.01)；而Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染實驗組與未轉(zhuǎn)染實驗組(72.35±6.53)比較，差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

2.4miRNA-411 Mimic 對于MDA-MB-231 細(xì)胞EMT 過程的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)相比Scrambled Mimic 轉(zhuǎn)染組有所提高，而未轉(zhuǎn)染組與Scrambled Mimic 轉(zhuǎn)染組間并無明顯差異。而miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)相比Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染組有所下降，而未轉(zhuǎn)染組與Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染組間并無明顯差異。見圖2。

圖1 miRNA-411 Mimic抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力(結(jié)晶紫染色，100倍)

圖2 miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染對E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響

2.5miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后， miRNA-411 Mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力為0.43±0.05，Scrambled Mimic轉(zhuǎn)染組為0.49±0.03，未轉(zhuǎn)染組為0.45±0.01，前者及后者與Scrambled Mimic 轉(zhuǎn)染組比較差異無顯著意義(P>0.05)。

3 討 論

乳癌發(fā)病率位于女性惡性腫瘤首位，其轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳癌病人死亡的首要原因[6]。因此，抑制乳癌轉(zhuǎn)移成為乳癌治療的關(guān)鍵。目前的研究結(jié)果顯示，miRNA參與乳癌發(fā)生發(fā)展，并最終導(dǎo)致乳癌浸潤和轉(zhuǎn)移。Vimentin蛋白是間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物，其在上皮性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志；E-cadherin蛋白是上皮細(xì)胞表面標(biāo)記物，其表達(dá)的丟失是EMT發(fā)生的另一重要標(biāo)志[4]；逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，使其重新表達(dá)E-cadherin蛋白，是抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的重要措施[7]。

miRNAs在EMT中充當(dāng)增強(qiáng)劑或抑制劑。例如，Twist能誘導(dǎo)miRNA-10b表達(dá)，這種miRNA能夠抑制HOXD10蛋白的翻譯并造成RhoC表達(dá)升高，促進(jìn)乳癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)乳癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8]。與之作用相反，miRNA-31通過協(xié)調(diào)抑制一系列促轉(zhuǎn)移基因(包括RhoA)，抑制EMT過程，從而抑制乳癌轉(zhuǎn)移[9]。

既往研究結(jié)果顯示，miRNA-411在乳癌組織中表達(dá)下調(diào)[5]。本研究結(jié)果顯示，相比低轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞，miRNA-411在高轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞中的表達(dá)水平更低，瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-411 Mimic，乳癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移與侵襲能力均明顯減弱，提示miRNA-411能夠抑制乳癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。E-cadherin是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-411 Mimic后，E-cadherin蛋白的水平顯著上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)水平則明顯下降。但是miRNA-411 Mimic對乳癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖沒有影響，說明miRNA-411對乳癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲的影響，不是通過抑制乳癌細(xì)胞的增殖能力，而是可能通過逆轉(zhuǎn)乳癌MDA-MB-231的EMT過程來實現(xiàn)。

綜上所述，miRNA-411可能通過抑制乳癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而抑制乳癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究為乳癌的診斷和治療提供了一個新的思路，miRNA-411可以作為預(yù)測乳癌侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，還可成為乳癌治療新靶點，這對于提高乳癌病人的生存率會起到極大的幫助。

[1] SIEGEL R, MA J M, ZOU Z H, et al. Cancer statistics, 2014[J]. CA-A Cancer Journal for Clinicians, 2014,64(1):9-29.

[2] DVINGE H, GIT A, GRAEF S, et al. The shaping and functional Consequences of the microRNA landscape in breast cancer[J]. Nature, 2013,497(7449):378-382.

[3] SONG S J, POLISENO L, SONG M S, et al. MicroRNA-antagonism regulates breast cancer stemness and metastasis via TET-family-dependent chromatin remodeling[J]. Cell, 2013,154(2):311-324.

[4] WENDT M K, SCHIEMANN B J, PARVANI J G, et al. TGF-β stimulates Pyk2 expression as part of an epithelial-me-senchymal transition program required for metastatic outgrowth of breast cancer[J]. Oncogene, 2013,32(16):2005-2015.

[5] VAN SCHOONEVELD E, WOUTERS M C, VAN DER AUWERA I, et al. Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers[J]. Breast Cancer Research: BCR, 2012,14(1): R34.

[6] 李美玲,高美華,宋云峰,等. Survivin和Caspase-3在乳癌組織的表達(dá)及相關(guān)性[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2009,24(5):377-379,382.

[7] QURESHI R, ARORA H, RIZVI M A. EMT in cervical cancer: its role in tumour progression and response to the-rapy[J]. Cancer Letters, 2015,356(2 Pt B):321-331.

[8] MA L, TERUYA-FELDSTEIN J, WEINBERG R A. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature, 2007,449(7163):682-688.

[9] VALASTYAN S, REINHARDT F, BENAICH N, et al. A pleiotropically acting microRNA, miR-31, inhibits breast cancer metastasis[J]. Cell, 2009,137(6):1032-1046.

(本文編輯 厲建強(qiáng))

EFFECT OF MIRNA-411 ON INVASION AND MIGRATION OF HUMAN BREAST CANCER CELLS

FANGJiankai,CHENWangwang,GUOLingling

(Department of Pathology and Pathophysiology, Medical College of Soochow University, Suzhou 215213, China)

ObjectiveTo investigate the impact of microRNA-411 (miRNA-411) on proliferation, migration and invasion of human breast cancer cell line MDA-MB-231.MethodsThe expression of miRNA-411 was detected in highly metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells and lowly metastatic breast cancer MCF-7 cells by real-time PCR assay. Employing LipofectamineTM2000, miRNA-411 mimic was transfected into breast cancer MDA-MB-231 cells. The transfection efficiency of miRNA-411 mimic was detected by real-time PCR assay, and the migration and ability of the cells measured by Transwell assay, the expressions of E-cadherin and vimentin by Western blotting, and the proliferation of the cells by MTT assay.ResultsThe expression of miRNA-411 in MDA-MB-231 cells was significantly lower than MCF-7 cells (t=7.45,P<0.01). After miRNA-411 mimic was transiently transfected into MDA-MB-231 cells, the migration and invasion of MDA-MB-231 cells were significantly inhibited (t=7.24,6.62;P<0.01). The expression of E-cadherin in infected cells elevated, and that of Vimentin declined. No significant impact of miRNA-411 mimic on the reproductive activity of MDA-MB-231 cells was noted (P>0.05).ConclusionmiRNA-411 is lowly expressed in highly metastatic breast cancer cells. The migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells are significantly inhibited after transfection with miRNA-411 mimic, the suppression of the migration and invasion is not due to reducing the proli-feration ability of MDA-MB-231 cells, but possibly through inversion of epithelial-mesenchymal transition of MDA-MB-231 cells.

breast neoplasms; MDA-MB-231; miRNA-411; cell movement; neoplasm invasiveness

2015-05-15;

2015-08-17

房建凱(1990-)，男，碩士研究生。

郭玲玲(1963-)，女，碩士，副教授。

R737.9

A

1008-0341(2015)06-0637-04