流式細胞術(shù)檢測肺泡灌洗液淋巴細胞免疫表型的臨床意義探討

楊紅 鹿英英 張中

流式細胞術(shù)檢測肺泡灌洗液淋巴細胞免疫表型的臨床意義探討

楊紅 鹿英英 張中

目的 探討流式細胞術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)淋巴細胞免疫表型的臨床意義。方法 應(yīng)用流式細胞儀雙色直接免疫熒光法對15例肺癌(肺癌組)和20例肺良性病變患者(良性病變組)的支氣管肺泡灌洗液T淋巴細胞亞群進行分析。結(jié)果 肺癌組肺泡灌洗液中、、比值均低于良性病變組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 肺癌組肺泡灌洗液中高于良性病變組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 肺部惡性腫瘤細胞免疫功能低下, 可以通過流式細胞術(shù)檢測肺泡灌洗液淋巴細胞免疫表型, 為臨床診斷肺部良、惡性病變提供有效依據(jù)。

肺泡灌洗液；流式細胞術(shù)；淋巴細胞免疫表型

流式細胞術(shù)具有高靈敏度、高速度和多參數(shù)分析的優(yōu)勢,其對血液中淋巴細胞免疫表型的分析, 為血液病、腫瘤、免疫性系統(tǒng)疾病的診治、器官移植、排斥反應(yīng)的監(jiān)測提供重要依據(jù)。故流式細胞術(shù)被認為是淋巴細胞免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法, 也是最主要的臨床應(yīng)用之一［1］。支氣管鏡的檢查, 可以直接獲取患者下呼吸道及肺泡上皮表面的肺泡灌洗液, 對其進行淋巴細胞免疫表型的檢測, 是反映肺局部細胞免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo), 可為肺部結(jié)節(jié)病、肺間質(zhì)纖維化、肺部惡性腫瘤等疾病的鑒別診斷和療效觀察提供幫助［2］, 其在臨床和實驗研究中受到廣泛重視。但是, 由于檢測方法的局限性, 應(yīng)用流式細胞儀檢測肺泡灌洗液淋巴細胞免疫表型的方法, 國內(nèi)尚未能普遍開展, 且報道甚少［3］。本院應(yīng)用流式細胞儀檢測了15例肺癌患者和20例肺良性病變患者支氣管肺泡灌洗液的淋巴細胞免疫表型, 探討其對肺部良、惡性疾病的鑒別診斷價值。具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 肺癌患者(肺癌組)共15例, 男11例, 女4例, 年齡31~75歲, 平均年齡56.5歲, 其中11例有吸煙史,全部經(jīng)纖維支氣管鏡及活組織病理確診。其中鱗癌8例, 小細胞未分化癌5例, 細支氣管肺泡癌1例, 1例未確定細胞類型。肺部良性病變患者(良性病變組)20例, 男16例, 女4例, 年齡32~76歲, 平均年齡49.5歲, 其中肺結(jié)核3 例, 肺炎8 例, 肺結(jié)節(jié)病 7 例, 支氣管擴張癥2例。

1.2 儀器與試劑 儀器：美國 BD FACSCalibur 流式細胞儀；試劑：雙色標(biāo)記熒光抗體 IgG1/IgG2a、CD45/CD14、CD3/CD4、CD3/CD8、紅細胞裂解液、熒光校準(zhǔn)微球 calibrate Beads 3-colour , 均購自美國 BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 BALF的制備 取新鮮 BALF 10 ml, 經(jīng)300目金屬網(wǎng)過濾去掉雜質(zhì)和痰液, 300 g, 5 min離心后棄上清, 再用含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次, 取BALF 100 μl加入20 μl熒光抗體, 室溫避光孵育20 min, 300 g, 5 min離心棄上清, 加 1∶9 配制的溶血素2 ml, 避光10 min, 200 g, 5 min離心棄上清液, 加入 PBS 緩沖液300 g, 5 min 離心, 棄上清, 加0.5 ml PBS重懸細胞上機待測。

1.3.2 流式細胞儀測定 以熒光微球calibrite Beads 3-colour校準(zhǔn)儀器光路使其分辨率達到最佳工作狀態(tài), 雙色免疫熒光染色, 采用Simultest 軟件, 三色熒光/側(cè)向散射光設(shè)門(CD45-PerCP/SSC-Gating), 設(shè)置淋巴細胞門并分析淋巴細胞免疫表型, 建立CD45-PerCP/SSC, FSC/SSC, SSC/CD3熒光點圖, 用CD3細胞群圈門以排除巨噬細胞、碎片及其他成分的干擾, 調(diào)節(jié) FSC、SSC 電壓, FSC 閾值, FL1-FL2% 、FL2-FL1% 熒光補償, 每管獲取1.5萬個細胞, 建立、散點圖, 根據(jù)同型對照設(shè)門分析和Ts的表達情況, 同時計算出 Th/Ts 比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

肺癌組和良性病變組肺泡灌洗液淋巴細胞免疫表型的結(jié)果比較, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌組和良性病變組淋巴細胞免疫表型的結(jié)果比較

表1 肺癌組和良性病變組淋巴細胞免疫表型的結(jié)果比較

注: 與良性病變組比較,aP＜0.05

組別例數(shù)CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+/CD8+良性病變組2065.3±6.944.2±3.526.1±1.731.73±0.13肺癌組15 51.2±2.9a35.3±2.61a29.6±1.90a1.41±0.11a

3 討論

3.1 肺泡灌洗液中含有以T淋巴細胞為主的免疫細胞［4］。T淋巴細胞是一群功能不同的異質(zhì)性淋巴細胞, 按細胞表面標(biāo)志不同, 可以分為T淋巴細胞和T淋巴細胞兩個群。T淋巴細胞經(jīng)抗原刺激后在不同細胞因子綜合作用下分化發(fā)育成輔助T淋巴細胞Th1或Th2, Th1細胞促進細胞免疫, 抑制體液免疫, 而Th2則促進體液免疫, 抑制細胞免疫, 二者的平衡決定著免疫應(yīng)答的方向［5］。T淋巴細胞是機體細胞免疫主要效應(yīng)細胞［6］。

3.2 流式細胞儀結(jié)合免疫熒光技術(shù)提高了肺泡灌洗液中T淋巴細胞亞群檢測的便捷和可靠性［7］, 并以散點圖的形式直觀地顯示出不同疾病時T淋巴細胞亞群的變化, 可作為反映肺局部細胞免疫狀態(tài)的一項免疫指標(biāo)［8］。

3.3 腫瘤患者常處于免疫功能低下狀態(tài), 腫瘤細胞可以產(chǎn)生一系列逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)的機制［9］。有學(xué)者認為機體發(fā)生腫瘤時, 在腫瘤局部的微環(huán)境發(fā)生免疫功能紊亂, Th、Ts平衡打破, 表現(xiàn)為局部的Ts亞群增高, Th/Ts比值減低［10］。本文肺癌組BALF中的比值明顯低于良性病變組, 與文獻報道一致。Ts細胞所占百分比增高, 提示肺癌患者局部細胞免疫功能紊亂, 是腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因［11］。支氣管肺泡灌洗液T淋巴細胞亞群的改變對肺部疾病的鑒別診斷有重要意義, 為臨床提供有效依據(jù)及輔助方法［12-14］。

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Investigation of clinical significance by flow cytometry for lymphocyte immunophenotyping detection in alveolar lavage fluid

YANG Hong, LU Ying-ying, ZHANG Zhong.Department of Inspection, Beijing Fengtai Hospital, Beijing 100070, China

Objective To investigate clinical significance of flow cytometry for lymphocyte immunophenotyping detection in bronchial alveolar lavage fluid (BALF).Methods Flow cytometry double color direct immunofluorescence method was applied in analysis of T lymphocytes subset in bronchial alveolar lavage fluid in 15 lung cancer cases (lung cancer group) and 20 lung benign lesion cases (benign lesion group).Results The lung cancer group had lower values ofratio in alveolar lavage fluid than the benign lesion group, and their difference had statistical significance (P＜0.05).The lung cancer group had highervalue than the benign lesion group, and their difference had statistical significance (P＜0.05).Conclusion The immunity function in lung cancer patients significantly decreases, and their lymphocyte immunophenotyping in alveolar lavage fluid can detected by flow cytometry, for providing effective reference for clinical diagnosis of benign and malignant lesion.

Alveolar lavage fluid; Flow cytometry; Lymphocyte immunophenotyping

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.006

2015-01-27］

100070 北京豐臺醫(yī)院檢驗科(楊紅), 呼吸科(鹿英英張中)