γ-氨基丁酸在氯胺酮抗抑郁中的作用

劉向六，劉文學(xué)，邱麗麗，張廣芬，周志強(qiáng)

0 引 言

全身麻醉藥氯胺酮屬于非選擇性N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-d-aspartate，NMDA)受體拮抗劑。近年來(lái)大量臨床及基礎(chǔ)研究均表明氯胺酮具有快速、顯著的抗抑郁作用，但具體作用機(jī)制仍不清楚［1－4］。既往研究表明氯胺酮可影響中樞興奮/抑制平衡［4－6］，可能在其抗抑郁中發(fā)揮作用。本研究擬觀察抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)在氯胺酮抗抑郁中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar 大鼠，32只，體重200 ～250 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0016668。在室溫25 ℃、相對(duì)濕度為45%的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠均分為等滲鹽水組、氯胺酮組、GABA 組及GABA+氯胺酮組，每組8 只。

1.2 側(cè)腦室置管 所有大鼠均進(jìn)行側(cè)腦室置管(導(dǎo)管及給藥系統(tǒng)購(gòu)于深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。過(guò)程如下:麻醉后將大鼠固定于立體定位儀上，暴露前囟，坐標(biāo)尺向后1.0 mm，旁開(kāi)1.5 mm，自硬腦膜面向下3.5 mm。22 號(hào)導(dǎo)管置管，玻璃離子水門汀固定，單籠飼養(yǎng)1 周。給藥時(shí)使用。

1.3 藥物干預(yù) 術(shù)后第8 天行強(qiáng)迫游泳15 min 制備急性應(yīng)激抑郁模型。造模后24 h，經(jīng)26 號(hào)注射內(nèi)管進(jìn)行側(cè)腦室給藥，等滲鹽水組及氯胺酮組給予等滲鹽水2 μL，GABA 組及GABA+氯胺酮組給予GABA 50 μg(2 μL，美國(guó)Sigma 公司)，GABA 劑量選擇依據(jù)文獻(xiàn)［7］。側(cè)腦室給藥后10 min 等滲鹽水組及GABA 組腹腔注射等滲鹽水1 mL，氯胺酮組及GABA+氯胺酮組腹腔注射氯胺酮10 mg/kg(1 mL，福建古田制藥廠)。

1.4 敞箱實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT) 腹腔給藥后30 min 應(yīng)用OFT 進(jìn)行大鼠自主活動(dòng)評(píng)分，由2 名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測(cè)評(píng)，取平均分。實(shí)驗(yàn)在1 個(gè)底面積為75 cm×75 cm、高40 cm 的敞箱內(nèi)進(jìn)行，底部均分為25 個(gè)方格。每只大鼠放在清潔敞箱的中央格，記錄大鼠在5 min 內(nèi)的各項(xiàng)得分。水平得分為大鼠水平穿越的方格數(shù)，大鼠3 或4 爪都進(jìn)入1 個(gè)方格記為1 分;垂直得分為兩前爪每離開(kāi)底面1 次記為1 分。

1.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)參考以往研究［8－9］，采用大鼠FST 建立急性應(yīng)激抑郁模型，即將大鼠置于高65 cm、直徑30 cm、盛有23 ℃～25 ℃自來(lái)水的清潔圓柱形玻璃缸中，水深40 cm，游泳15 min。OFT 后即刻將大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min 進(jìn)行測(cè)試，觀察并記錄后5 min 大鼠的不動(dòng)時(shí)間。行為學(xué)測(cè)試由2 名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測(cè)評(píng)，取平均值。

1.6 GABA 含量測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，取大鼠大腦前額皮層，采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)測(cè)定GABA 水平。向預(yù)先包被了大鼠GABA 單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入待測(cè)樣品40 μL，37 ℃溫育60 min，加生物素標(biāo)記的抗GABA 抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入顯色劑，37 ℃避光顯色10 min，加終止液終止反應(yīng)。在450 nm 處測(cè)光密度(A)值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中GABA 含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氯胺酮對(duì)FST 大鼠不動(dòng)時(shí)間的影響 與氯胺酮組比較，等滲鹽水組、GABA組、GABA+氯胺酮組不動(dòng)時(shí)間增加(P ＜0.05)，與GABA組比較，GABA+氯胺酮組不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 氯胺酮對(duì)大鼠前額皮層GABA 含量的影響

與氯胺酮組比較，等滲鹽水組、GABA 組、GABA+氯胺酮組大鼠前額皮層GABA 含量均升高(P ＜0.05)，與GABA 組比較，GABA+氯胺酮組大鼠前額皮層GABA 含量下降(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 氯胺酮對(duì)FST 大鼠不動(dòng)時(shí)間和前額皮層GABA 含量的影響Table 1 The effects of ketamine on the immobility time of FST and GABA level in prefrontal cortex in rats

表1 氯胺酮對(duì)FST 大鼠不動(dòng)時(shí)間和前額皮層GABA 含量的影響Table 1 The effects of ketamine on the immobility time of FST and GABA level in prefrontal cortex in rats

與氯胺酮組比較，*P ＜0.05;與GABA 組比較，#P ＜0.05

組別 n 不動(dòng)時(shí)間(s) 前額(n皮g層/mg G·A B pr Ao t含)量等滲鹽水組 8 167.2±22.1* 23.3±6.3*氯胺酮組 8 107.5±21.2 12.4±3.4 GABA 組 8 159.8±17.5* 27.3±5.7*GABA+氯胺酮組 8 143.8±22.1* 18.0±5.4*#

2.3 氯胺酮對(duì)大鼠OFT 水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響 4 組大鼠水平運(yùn)動(dòng)OFT 得分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，垂直運(yùn)動(dòng)OFT 得分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 氯胺酮對(duì)大鼠OFT 水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響，分)Table 2 The effects of ketamine on the crossing and the rearing scores of OFT in rats，score)

表2 氯胺酮對(duì)大鼠OFT 水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響，分)Table 2 The effects of ketamine on the crossing and the rearing scores of OFT in rats，score)

分組 n 水平運(yùn)動(dòng)O F T得分垂直運(yùn)動(dòng)等滲鹽水組8 54.250±6.884 7.625±1.782氯胺酮組 8 50.750±7.842 6.375±1.475 GABA 組 8 52.375±7.421 7.625±1.908 GABA+氯胺酮組8 52.125±8.993 7.000±1.309

3 討 論

抑郁癥狀為心境障礙的一種臨床癥狀，抑郁癥是以顯著而持久的心境低落、思維遲緩、認(rèn)知功能損害、意志活動(dòng)減退和軀體癥狀為主要臨床特征的一類心境障礙［10］。強(qiáng)迫游泳所致抑郁模型屬于行為絕望模型，當(dāng)大鼠被迫在局限的空間游泳，它們首先拼命地泳動(dòng)試圖逃跑，隨后處于一種漂浮的不動(dòng)狀態(tài)，僅露出鼻孔維持呼吸，四肢偶爾劃動(dòng)以保持身體不至于沉下去，這種狀態(tài)即不動(dòng)狀態(tài)，屬于“行為絕望”。該模型具有簡(jiǎn)單、快速、敏感等特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于探討氯胺酮抗抑郁機(jī)制的研究絕大多數(shù)采用此模型，因此在本實(shí)驗(yàn)中也選用此模型。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮10 mg/kg 給藥后30 min，大鼠FST 不動(dòng)時(shí)間明顯下降，再次證實(shí)了氯胺酮快速有效地抗抑郁作用。

GABA 是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的主要類型，GABA 增多能夠抑制興奮性神經(jīng)元，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸合成減少，從而減弱突觸再生相關(guān)信號(hào)，促進(jìn)抑郁癥發(fā)生［11－12］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮在大鼠急性抑郁模型中產(chǎn)生確切的抗抑郁作用，同時(shí)伴隨大鼠前額皮層GABA 下調(diào)，這提示氯胺酮的抗抑郁作用可能與GABA 下調(diào)有關(guān)［4］。本研究采用側(cè)腦室給藥預(yù)先補(bǔ)充GABA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予氯胺酮后并未減少大鼠FST 不動(dòng)時(shí)間。氯胺酮給藥后30 min 大鼠前額皮層GABA 含量顯著下降，側(cè)腦室補(bǔ)充GABA 后大鼠前額皮層GABA 含量增加，同時(shí)阻斷了氯胺酮抗抑郁作用。雖然與GABA 組相比，GABA+氯胺酮組大鼠前額皮層GABA 含量顯著下降，但兩組之間FST 不動(dòng)時(shí)間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是側(cè)腦室給藥后大鼠腦組織GABA 基礎(chǔ)含量較高從而導(dǎo)致氯胺酮未能發(fā)揮抗抑郁作用。根據(jù)以上結(jié)果并結(jié)合以往研究，推測(cè)氯胺酮可能通過(guò)抑制大鼠前額皮層GABA 生成，從而減弱對(duì)興奮性神經(jīng)元的抑制作用，導(dǎo)致谷氨酸水平升高，進(jìn)一步激活突觸再生相關(guān)信號(hào)，促進(jìn)突觸再生，從而產(chǎn)生抗抑郁作用。

另外本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室單獨(dú)給予GABA對(duì)大鼠不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯影響，且各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)等運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分無(wú)顯著差異，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠均未死亡，據(jù)此可排除實(shí)驗(yàn)操作及藥物處理對(duì)大鼠自主活動(dòng)的影響。

有關(guān)GABA 對(duì)突觸后相關(guān)信號(hào)通路分子的影響及在氯胺酮抗抑郁中的作用尚需更多的研究來(lái)闡明，以期為研發(fā)快速有效的新型抗抑郁藥提供理論參考。

［1］ Murrough JW，Iosifescu DV，Chang LC，et al.Antidepressant efficacy of ketamine in treatment-resistant major depression:a two-site randomized controlled trial［J］.Am J Psychiatry，2013，170(10):1134-1142.

［2］ Zhang GF，Wang N，Shi JY，et al.Inhibition of L-arginine-nitric oxide pathway mediates the antidepressant effects of ketamine on rats in the forced swimming test［J］.Pharmacol Biochem Behav，2013，110:8-12.

［3］ Xu SX，Zhou ZQ，Li XM，et al.The activation of adenosine monophosphate-activated protein kinase in rat hippocampus contributes to the rapid antidepressant effect of ketamine［J］.Behav Brain Res，2013，253:305-309.

［4］ 張廣芬，李曉敏，王 楠，等.微清蛋白中間神經(jīng)元在氯胺酮致大鼠精神分裂樣表現(xiàn)中的作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(1):9-11.

［5］ Sequeira A，Mamdani F，Ernst C，et al.Global brain gene expression analysis links glutamatergic and GABA ergic alterations to suicide and major depression［J］.PLoS One，2009，4(8):6585.

［6］ Lee PH，Perlis RH，Jung JY，et al.Multi-locus genome-wide association analysis supports the role of glutamatergic synaptic transmission in the etiology of major depressive disorder［J］.Transl Psychiatry，2012，2:184.

［7］ Trudeau VL，Kah O，Chang JP，et al.The inhibitory effects of(gamma)-aminobutyric acid(GABA)on growth hormone secretion in the goldfish are modulated by sex steroids［J］.J Exp Biol，2000，203(9):1477-1485.

［8］ De Vry J，Schreiber R，Melon C，et al.5-HT1A receptors are differentially involved in the anxiolytic-and antidepressant-like effects of 8-OH-DPAT and fluoxetine in the rat［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2004，14(6):487-495.

［9］ Li N，Lee B，Liu RJ，et al.mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists［J］.Science，2010，329(5994):959-964.

［10］ 王 睿，黃樹(shù)明.抑郁癥發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(12):1332-1336.

［11］ Li N，Liu RJ，Dwyer JM，et al.George Aghajanian，and Ronald S.Duman Glutamate N-methyl-D-aspartate receptor antagonists rapidly reverse behavioral and synaptic deficits caused by chronic stress exposure［J］.Biol Psychiatry，2011，69(8):754-761.

［12］ Dwyer JM，Duman RS.Activation of mammalian target of rapamycin and synaptogenesis:role in the actions of rapid-actingantidepressants［J］.Biol Psychiatry，2013，73(12):1189-1198.