粒細胞集落刺激因子治療反復胚胎種植失敗患者的研究

何 峻，陳朝軍，周 樺

(1.貴州省人民醫(yī)院生殖中心； 2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖中心,貴陽 550002)

粒細胞集落刺激因子治療反復胚胎種植失敗患者的研究

何 峻1，陳朝軍1，周 樺2

(1.貴州省人民醫(yī)院生殖中心； 2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖中心,貴陽 550002)

目的 探討粒細胞集落刺激因子(G-CSF)宮腔灌注治療反復胚胎種植失敗患者的療效。方法 按隨機數(shù)字表法選擇2013年3月至2014年6月在貴州省人民醫(yī)院生殖中心行輔助助孕反復胚胎種植失敗的患者共82例，在取卵日或凍融胚胎移植前的排卵日/黃體酮注射日/HCG注射日行重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF，150 μg·mL-1，1 mL)宮腔灌注，作為G-CSF組(38例)，未行宮腔灌注的其他反復胚胎種植失敗的患者作為對照組(44例)。結(jié)果G-CSF組與對照組相比，F(xiàn)ET患者中G-CSF組與對照組相比胚胎種植率較高，臨床妊娠率也較高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義。IVF-ET患者中G-CSF組與對照組相比胚胎種植率較高，但臨床妊娠率無明顯升高。2組間臨床基本情況無明顯統(tǒng)計學意義。結(jié)論 G-CSF治療對反復胚胎種植失敗的FET患者能顯著提高胚胎種植率和臨床妊娠率，但在IVF-ET周期僅能提高胚胎種植率，不能降低流產(chǎn)率。

粒細胞集落刺激因子； 反復胚胎種植失敗； 胚胎種植； 妊娠率

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo,IVF-ET)是一種昂貴的、耗時的，但是有效的不孕癥的治療手段。到目前為止，其成功率仍徘徊在40%左右。很多夫妻在嘗試了多次IVF-ET后仍然未能受孕，導致生活質(zhì)量受到很大的影響，且每一次失敗都對經(jīng)濟造成了一定的負擔。這種反復胚胎種植失敗(repeated implantation failure,RIF)是指在移植了3個優(yōu)質(zhì)胚胎或多次移植了≥10個胚胎后達到或超過5周時B超未發(fā)現(xiàn)孕囊，移植≥10個高質(zhì)量胚胎仍未妊娠者被定義為反復種植失敗[1]。另外也有一些學者將RIF定義為經(jīng)歷3個取卵周期，且每個周期均有優(yōu)質(zhì)胚胎移植，著床失敗或妊娠丟失[2]。RIF的原因主要分為母體因素和胚胎因素兩方面。生殖醫(yī)學工作者一直在尋找各種RIF的原因，包括：子宮內(nèi)膜種植窗期的選擇、宮腔鏡排除內(nèi)膜病變或異常、各種藥物改善子宮內(nèi)膜血流及厚度、各種黃體支持方案、改善胚胎培養(yǎng)程序提高優(yōu)胚率等等，但療效報道不一。在排除了子宮內(nèi)膜和宮腔因素以及不合理的內(nèi)膜種植期選擇外，仍有很多不明原因的胚胎種植失敗病例。

Gleicher等[3]在2011年首次報道應(yīng)用粒細胞集落刺激因子(G-CSF)治療薄型子宮內(nèi)膜獲得較好結(jié)局，這為治療反復胚胎種植失敗提供了新的治療思路。因此，本研究擬對RIF患者(宮腔鏡排除內(nèi)膜病變及宮腔異常)行宮腔灌注G-CSF，旨在探討G-CSF對治療結(jié)局的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

按隨機數(shù)字表法選擇2013年3月至2014年6月在貴州省人民醫(yī)院生殖中心行IVF-ET或凍融胚胎移植術(shù)(FET)的RIF患者各44例及38例，之前先行宮腔鏡排除子宮內(nèi)膜病變及宮腔異常，同時排除染色體異?；蛘邇?nèi)科疾病等原因造成胚胎種植失敗。在取卵日或凍融胚胎移植前3 d行重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF，150 μg·mL-1，1 mL)宮腔灌注，作為G-CSF組(38例)，未行宮腔灌注的其他RIF患者作為對照組(44)例。

1.2 內(nèi)膜監(jiān)測

IVF-ET周期定期監(jiān)測B超，記錄子宮內(nèi)膜形態(tài)、厚度，于取卵后第3天行新鮮胚胎移植術(shù)。對于FET周期，月經(jīng)規(guī)律者選擇自然排卵周期行凍融胚胎移植術(shù)；月經(jīng)周期紊亂者行人工藥物周期或促排卵周期，待子宮內(nèi)膜達標后或排卵后擇期行凍融胚胎移植術(shù)。人工藥物周期從月經(jīng)來潮第3天起口服補佳樂(廣州拜耳醫(yī)藥)2 mg·d-1，超聲監(jiān)測內(nèi)膜厚度，根據(jù)內(nèi)膜反應(yīng)每4 d逐漸遞增藥物劑量，直至最大劑量8 mg·d-1。對于促排卵周期行FET者，從月經(jīng)來潮第3天起口服來曲唑5 mg·d-1，連用5 d，后續(xù)聯(lián)合應(yīng)用人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，珠海麗珠制藥)75 IU·d-1，超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育和內(nèi)膜厚度，適時應(yīng)用HCG刺激排卵。排卵后第3天行凍融胚胎移植術(shù)。

1.3 宮腔灌注G-CSF

FET患者在排卵日或黃體酮/HCG注射日宮腔灌注150 μg(1 mL)的人重組G-CSF(商品名立升素，北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司)。IVF-ET患者在取卵日行宮腔灌注相同劑量人重組G-CSF。術(shù)前簽署知情同意書。

方法：常規(guī)消毒外陰、陰道，用1 mL注射器連接COOK一次性人工授精管，抽吸1 mL G-CSF并將管子放置入宮腔，抵達宮腔底部后輕微回退，緩慢注入藥液。取出人工授精管，患者保持平臥位30 min后結(jié)束治療。

1.4 觀察指標

主要觀察指標是每個移植周期的胚胎種植率和臨床妊娠率。研究中排除年齡過大(≥40歲)和無優(yōu)質(zhì)胚胎者，以及因子宮內(nèi)膜≤6 mm而取消移植周期者。根據(jù)IstanbulD胚胎形態(tài)學評價標準[4]，評分1級的卵裂期胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床基本情況

全部患者的臨床資料詳見表1及表2，年齡、孕次、不孕類型、不孕年限、BMI在G-CSF治療組和對照組之間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。對照組1例患者FET周期內(nèi)膜厚度<6 mm，患者簽字要求新鮮胚胎移植。對照組5例患者FET周期子宮內(nèi)膜厚度在6～7 mm之間，其中1例移植后發(fā)生流產(chǎn)。對照組IVF-ET周期中有2例發(fā)生流產(chǎn)，G-CSF組未發(fā)生流產(chǎn)。

組別n年齡/歲孕次不孕類型/%原發(fā)繼發(fā)不孕年限/年BMI/(kg·m-2)對照組4432.15±3.451.06±1.1730.7769.234.98±3.1220.76±3.01G-CSF組3831.92±3.2231.24±1.2132.7367.273.76±3.3120.23±2.98

組別n年齡/歲孕次/次/%(n)不孕類型例%例%不孕年限/年BMI/(kg·m-2)對照組4431.32±3.681.56±1.281431.823068.185.32±3.9820.83±2.45G-CSF組3832.58±3.111.34±1.391539.472360.524.44±2.5221.04±2.66

2.2 FET周期內(nèi)膜準備方案和治療結(jié)局比較

FET周期中有41例行誘發(fā)排卵治療，其中20例為G-CSF組；有18例患者行自然周期(NC)排卵，其中5例為G-CSF組；此外有23例患者為人工藥物周期(HRT)，其中13例為G-CSF組。與對照組比較G-CSF組誘導排卵比例較高，自然周期比較較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組間移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。G-CSF組與對照組比較，胚胎種植率及臨床妊娠率均較高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義P<0.05)。見表3。

表3 FET周期內(nèi)膜準備方案和治療結(jié)局比較

2.3 IVF-ET周期治療結(jié)局比較

IVF-ET周期中對照組和G-CSF組比較，2組間獲卵數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、HCG日血P值及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2組間胚胎種植率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，2組臨床妊娠率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 IVF-ET周期治療結(jié)局比較

由于流產(chǎn)例數(shù)和異位妊娠例數(shù)過少，故本研究未進行相關(guān)比較。

3 討論

胚胎種植是一個復雜而精細的過程，需要有高質(zhì)量的胚胎、具有良好容受性的子宮內(nèi)膜以及母體在時空上恰當?shù)拿庖呋砻饣蛎庖吒淖兎娇色@得成功妊娠。子宮內(nèi)膜容受性受到類固醇激素、細胞因子、免疫分子等網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。任何一個或幾個因子或激素表達或分泌水平出現(xiàn)問題都有可能導致子宮內(nèi)環(huán)境變化異常，從而影響胚胎種植導致不孕。而近年來對粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的研究不斷深入，其在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性以及影響胚胎種植的作用也越來越多地受到關(guān)注。

G-CSF是功能很強的刺激骨髓造血細胞增殖分化的細胞因子，人們較少意識到，其實G-CSF還可以作用于人體內(nèi)多種成熟細胞，促進并維持其正常的生理功能。在女性生殖方面，G-CSF被證實參與卵泡生長發(fā)育、排卵、卵巢刺激和妊娠等多個環(huán)節(jié)[5-8]。研究還發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜和母胎界面均有G-CSF及其受體的表達。孕早期胎盤絨毛細胞與母體蛻膜基質(zhì)細胞是GM-CSF的主要來源，小鼠蛻膜淋巴細胞存在GM-CSF受體，在人子宮基質(zhì)CD56+細胞和CD3+細胞均可檢測到GM-CSF受體，IL-2能夠誘導小鼠與人體蛻膜淋巴細胞激活殺傷細胞的產(chǎn)生，該細胞能夠?qū)ψ甜B(yǎng)細胞產(chǎn)生細胞溶解作用，而GM-CSF作為蛻膜NK細胞與NK T細胞的免疫調(diào)節(jié)因子則可抑制NK細胞與淋巴細胞激活殺傷細胞的細胞溶解功能以及誘導Th2反應(yīng)。體外實驗證實100 IU的G-CSF能夠完全抑制IL-2和IL-2誘導的蛻膜CD56+單核細胞分泌的干擾素γ(IFNγ)以及IL-2和IL-2所致的絨毛膜癌細胞的細胞溶解反應(yīng)[9-11]。Gleicher等[3，12]報道了利用宮腔內(nèi)灌注30 MU的rhG-CSF可以改善薄型子宮內(nèi)膜患者的子宮內(nèi)膜狀態(tài)并獲得妊娠。

在整個妊娠期間，母體血清G-CSF維持在一個較高的水平，妊娠早期和足月分娩時，胎兒絨毛組織和母體蛻膜組織都可以分泌G-CSF，這為G-CSF的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。然而，外源性宮腔灌注的G-CSF是如何在內(nèi)膜組織發(fā)揮作用以及影響內(nèi)膜容受性和胚胎種植，目前尚無涉及該方面的機制研究。筆者推測，外源性G-CSF作為化學刺激物，宮腔灌注作為機械刺激，可能激活內(nèi)分泌-旁分泌作用途徑，誘發(fā)內(nèi)源性多種細胞因子分泌，從而影響內(nèi)膜容受性和胚胎種植。G-CSF應(yīng)用的安全性，本研究沒有觀察到任何副反應(yīng)，可能因為G-CSF治療是低劑量，并且經(jīng)宮腔灌注局部應(yīng)用。文獻報道G-CSF主要的不良反應(yīng)是流感樣癥狀，而且非常輕微[1-2]。慢性中性粒細胞減少癥患者需要長期應(yīng)用G-CSF，包括妊娠期間，有研究數(shù)據(jù)表明這些患者的妊娠結(jié)局以及出生子代的生長發(fā)育未受藥物影響。

子宮內(nèi)膜局部的免疫異?？赡苁菍е虏幻髟蚍磸头N植失敗的可能原因之一。種植窗期內(nèi)膜的多種蛋白、細胞因子的時相性改變是胚胎成功種植的關(guān)鍵因素。今年來很多學者嘗試了不同的治療方式試圖對種植窗期子宮內(nèi)膜進行免疫調(diào)節(jié)，包括：自體的T淋巴細胞宮腔灌注、HCG宮腔內(nèi)膜灌注等，鑒于GM-CSF對子宮內(nèi)膜基質(zhì)內(nèi)DC、T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用、增強子宮內(nèi)膜環(huán)氧化酶活性以及促進PGE2分泌促進內(nèi)膜增殖及血管形成的作用、在子宮內(nèi)膜可能存在的局部抗炎作用等，筆者利用低劑量的rhG-CSF對反復種植失敗的患者進行了宮腔內(nèi)灌注治療，初步結(jié)果顯示rhG-CSF宮腔灌注能夠提高胚胎種植率，降低流產(chǎn)率。筆者還將繼續(xù)對G-CSF宮腔灌注的治療時間、治療次數(shù)、治療劑量以及適用人群做進一步的研究。

[1] Harton G,Braude P,Lashwood A,et al.ESHRE PGD consortium best practice guidelines for organization of a PGD centre for PGD/preimplantation genetic screening[J].Hum Reprod,2011，26(1)：14-24.

[2] Das M,Holzer H E G.Recuttent implantation failure:gamete and embryo factors [J].Fertil Steril,2012,97(5):1021.

[3] Gleicher N,Vidali A,Barad D H.Successful treatment of unresponsive thin endometrium [J].Fertil Steril,2011,95:2123.E13-17.[4] Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology.The Istanbul consensus workshop on embryo assessment:proceedings of an expert meeting[J].Hum Reprod,2011,26:1270-1283.

[5] Makinoda S,Mikuni M,Furuta I,et al.Serum concentration of endogenous G-CSF in women during the menstrual cycle and pregnancy[J].Eur J Clin Invest,1995,25:877- 879.

[6] Yanagi K,Makinoda S,Fujii R,et al.Cyclic changes of granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF) mRNA in the human follicle during the normal menstrual cycle and immunolocalization of G-CSF protein[J].Hum Reprod,2002,17:3046-3052.

[7] Hock D L,Huhn R D,Kemmann E.Leukocytosis in response to exogenous gonadotrophin stimulation[J].Hum Reprod,1997,12:2143-2146.

[8] Salmassi A,Schmutzler A G,Schaefer S,et al.Is granulocyte colony-stimulating factor level predictive for human IVF outcome[J].Hum Reprod,2005,20:2434-2440.[9] Plaks V,Biroberg T,Berkutzki T,et al.Uterine DCs are crucial for decidus for mation during embryo implantation in mice[J].J Clin Invest,2008,118:3954-3965.[10] Askelund K,Liddell H S,Zanderigo A M,et al.CD83(+) dendritic cells in the decidua of women with recurrent miscarriage and normal pregnancy[J].Placenta,2004,25:140-145.

[11] Moldenhauer L M,Keenihan S N,Hayball J D,et al.GM-CSF is an essential regulator of T cell activation competence in uterine dendritic cells during early pregnancy in mice[J].Immunol,2010,185：7085-7095.[12] Gleicher N,Kim A,Michaeli T,et al.Apilot cohort study of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of unresponsive thin endometrium resisitant to standard theraples[J].Hum Reprod,2013,Jan;28(1):172-177.

(責任編輯：劉大仁)

Granulocyte Colony-Stimulating Factor for Repeated Implantation Failure after Embryo Transfer

HE Jun1，CHEN Chao-jun1，ZHOU Hua2

(1.ReproductiveCenter,GuizhouProvincialPeople’sHospital; 2.ReproductiveCentre，theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550002,China)

Objective To evaluate the efficacy of uterine perfusion of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in the treatment of repeated implantation failure (RIF) after embryo transfer.Methods Eighty-two infertile patients with RIF who underwent embryo transfer in the Reproductive Centre of Guizhou Provincial People’s Hospital from March 2013 to June 2014 were given uterine infusion of recombinant human G-CSF (150 μg/1 mL) on the day of oocyte collection,the day of ovulation before frozen embryo transfer,the day of progesterone injection,or the day of human chorionic gonadotropin injection (G-CSF group).In addition,RIF patients who did not underwent uterine infusion were selected as the control group.Results Compared with control group,the implantation rate and clinical pregnancy rate among FET patients and the implantation rate among IVF-ET patients significantly increased in G-CSF group.There was no significant difference in clinical basic situation between the two groups.Conclusion G-CSF treatment can improve both embryo implantation rate and clinical pregnancy rate in FET patients with RIF.However,G-CSF treatment can only increase embryo implantation rate but can not reduce abortion rate in IVF-ET patients with RIF.

granulocyte colony-stimulating factor; repeated implantation failure; embryo implantation; pregnancy rate

2014-10-24

何峻(1980—)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事生殖內(nèi)分泌學的研究。

陳朝軍，副主任醫(yī)師，E-mail：819404691@qq.com。

R698+.2

A

1009-8194(2015)02-0064-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2015.02.029