甘草不同功能基因拷貝數(shù)多態(tài)性組合類型與葉片形態(tài)及甘草酸含量的相關(guān)性分析

王禮強(qiáng)，楊瑞，袁伯川，劉春生，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102

甘草是我國(guó)最常用的大宗藥材之一，具有補(bǔ)脾 益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和諸藥等作用[1]。甘草中最主要的活性成分甘草酸通過(guò)甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑合成[2]，此途徑受為數(shù)眾多的關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，其中3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA re?ductase，HMGR）是該途徑的第一個(gè)限速酶[3]。鯊稀合成酶1（squalene synthetase 1，SQS1）是碳源流向三萜的關(guān)鍵酶，當(dāng)其正向調(diào)節(jié)時(shí)，可促進(jìn)三萜類化合物的合成[4-5]。β-香樹(shù)酯醇合成酶（beta-amyrin syn?thase，β-AS）是控制形成甘草酸類化合物（齊墩果烷型）或白樺酯酸類化合物（羽扇豆烷型）的分支點(diǎn)，是甘草酸生物合成的關(guān)鍵酶[6]。近年來(lái)次生代謝途徑上關(guān)鍵酶對(duì)應(yīng)的功能基因已逐漸成為藥用植物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，功能基因的多態(tài)性對(duì)于調(diào)控產(chǎn)物的合成具有顯著影響。對(duì)于甘草來(lái)說(shuō)，以上3個(gè)MVA代謝途徑關(guān)鍵酶對(duì)應(yīng)的功能基因則有可能是導(dǎo)致其甘草酸含量差異的分子基礎(chǔ)。

功能基因的多態(tài)性既包括結(jié)構(gòu)變異，也包括數(shù)量變異。其中，拷貝數(shù)多態(tài)性（copy number varia?tions，CNV）是指與基因組參考序列相比，基因組中大于1 kb的DNA片段缺失、插入、重復(fù)或擴(kuò)增及其互相組合衍生出的復(fù)雜變異[7]?；騽┝康母淖儠?huì)引起相應(yīng)的酶含量的改變，進(jìn)而影響次生代謝產(chǎn)物的含量，因此功能基因的CNV往往與次生代謝產(chǎn)物含量之間具有密切的相關(guān)性。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，不同甘草植株中功能基因HMGR、SQS1及β-AS的確存在拷貝數(shù)上的變化[8-9]，而這些變化是否會(huì)影響次生代謝產(chǎn)物甘草酸的合成，還有待進(jìn)一步探討?；虻亩鄳B(tài)性除了會(huì)影響次生代謝產(chǎn)物的含量，還有可能引起植物表觀特征的改變[10]，因此功能基因的不同CNV也有可能對(duì)應(yīng)不同的表觀性狀特征?；谝陨显?，我們從甘草酸代謝途徑的HMGR、SQS1和β-AS基因入手，研究這3個(gè)功能基因CNV與甘草酸含量及甘草葉片形態(tài)特征的相關(guān)性，為高品質(zhì)甘草的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將采自7個(gè)產(chǎn)地的甘草成熟種子栽培于北京中醫(yī)藥大學(xué)藥草園，生長(zhǎng)1年后經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralen?sis Fisch.），取其中60株作為本實(shí)驗(yàn)的樣本（表1）。

SYBR GreenⅠ PCR Master Mix購(gòu)于ABI公司；LA Taq DNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司；廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和DL2000核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于北京博邁德科技發(fā)展有限公司；甘草酸銨（編號(hào)：110731）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（CALEDON，色譜純）、甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、磷酸（分析純）購(gòu)于北京匯?？苾x有限公司。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用植物材料情況統(tǒng)計(jì)表

Thermo Cell恒溫金屬??；SIGMA 3K-15低溫高速離心機(jī)；JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；TECHNE TC-3000 PCR擴(kuò)增儀；Bio-Rad電泳儀；555牌游標(biāo)卡尺（0～150 mm，分度值 0.02 mm，采用標(biāo)準(zhǔn) GB/T12141-1996）；Agilent 1100型高效液相色譜儀；Agilent 1100化學(xué)工作站；Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 甘草材料中功能基因拷貝數(shù)的測(cè)定

取甘草植物材料的嫩葉，按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取甘草總DNA。具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

選擇Lectin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因[8-9]，根據(jù)光果甘草Lectin基因序列（GeBank：HQ337023.1，AJ234389.1），甘草HMGR序列（GQ845405.1，JF461267.1）、SQS1序列（HM012838.1，HM012837.1，GQ180932.1）及β-AS序列（FJ627179.1，GU072921.1）設(shè)計(jì)各基因?qū)?yīng)引物（表2），由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25 μL，含 12.5 μL 2×SYBR Green qPCR mix、1.0 μL 正 向 引 物（5 μmol/L）、1.0 μL反向引物（5 μmol/L）、4.0 μL模板和6.5 μL H2O。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，4℃保存。

將含有HMGR、SQS1、β-AS、Lectin基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1×10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106拷貝/μL，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。以待測(cè)樣品的DNA為模板，利用所建立的實(shí)時(shí)PCR方法，對(duì)甘草HMGR、SQS1、β-AS基因的Ct值進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)3次，將所得Ct值帶入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行換算，得到相對(duì)含量。通過(guò)HMGR、SQS1、β-AS與內(nèi)標(biāo)基因Lectin基因的比值得到相應(yīng)的拷貝數(shù)。

1.3 甘草葉片形態(tài)特征分析

表2 實(shí)時(shí)PCR引物

根據(jù)以上3個(gè)基因拷貝數(shù)的測(cè)定結(jié)果，對(duì)60株甘草樣品進(jìn)行分類。對(duì)不同CNV組合類型甘草的葉片形態(tài)特征進(jìn)行分析，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量復(fù)葉長(zhǎng)度、小葉長(zhǎng)度和寬度、頂葉長(zhǎng)度和寬度，并對(duì)各測(cè)量值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各特征解釋如下：①?gòu)?fù)葉長(zhǎng)：植株中部一級(jí)側(cè)枝中部二級(jí)側(cè)枝中部復(fù)葉的長(zhǎng)度；②小葉長(zhǎng)、寬：植株中部一級(jí)側(cè)枝中部二級(jí)側(cè)枝中部復(fù)葉的中部小葉的長(zhǎng)、寬；③頂葉長(zhǎng)、寬：植株中部一級(jí)側(cè)枝中部二級(jí)側(cè)枝中部復(fù)葉的頂葉的長(zhǎng)、寬。

1.4 甘草酸含量測(cè)定

參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》[12]對(duì)樣品中的甘草酸含量進(jìn)行測(cè)定。

以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表3條件進(jìn)行梯度洗脫。取甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇配制成0.2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取甘草酸銨儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于7個(gè)5 mL容量瓶中，用70%乙醇定容到刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)系列。進(jìn)樣10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線形回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。甘草酸含量=甘草酸銨含量/1.0207。

取樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲波處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。吸取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

表3 HPLC梯度洗脫條件

2 結(jié)果

2.1 HMGR、SQS1、β-AS基因拷貝數(shù)的測(cè)定

利用實(shí)時(shí)PCR方法所建立的內(nèi)標(biāo)基因和待測(cè)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

PCR測(cè)定60份甘草樣品中的HMGR、SQS1、β-AS及Lectin基因，根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中3個(gè)功能基因的拷貝數(shù)，按照計(jì)算結(jié)果將60株甘草分為A、B、C、D、E、F共6種類型（表4）。

2.2 不同功能基因CNV組合類型甘草葉片形態(tài)特征分析

對(duì)6種CNV組合類型甘草葉片的形態(tài)特征進(jìn)行分析，結(jié)果如表5和圖1。

由圖1A可知，A、B及F型的復(fù)葉長(zhǎng)度較長(zhǎng)，而C、D及E型的復(fù)葉長(zhǎng)度較短。對(duì)各類型甘草復(fù)葉長(zhǎng)度進(jìn)行t檢驗(yàn)，絕大多數(shù)組別在復(fù)葉長(zhǎng)度方面具有顯著性差異（P＜0.05），只有C與E型間P值為0.960，無(wú)顯著性差異。

由圖1B可知，A與D型的小葉長(zhǎng)度較短，其他類型小葉長(zhǎng)度較長(zhǎng)。對(duì)小葉長(zhǎng)度進(jìn)行t檢驗(yàn)，大多數(shù)組間均存在顯著性差異，特別是A、D型與其他所有組之間P值均小于0.05。由圖1C可知，A與D型的小葉寬度較窄，而其他類型的小葉寬度較寬。對(duì)小葉寬度進(jìn)行t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有C與F型間不存在顯著性差異，P值為0.660（＞0.05），其余各組之間均存在顯著性差異。綜合以上對(duì)小葉長(zhǎng)度及寬度的分析，我們發(fā)現(xiàn)A與D型在小葉長(zhǎng)度和寬度方面數(shù)值均較小，小葉的整體面積均小于其他類型，而B(niǎo)與E型在小葉長(zhǎng)度和寬度方面數(shù)值均較大，小葉的整體面積均大于其他類型。

表4 60份甘草樣品中HMGR、SQS1、β-AS基因拷貝數(shù)組合類型

表5 不同功能基因CNV組合類型甘草葉片形態(tài)參數(shù)統(tǒng)計(jì)表（n=9）

圖1 6種CNV組合類型甘草葉片形態(tài)特征分析A：甘草復(fù)葉長(zhǎng)度；B：甘草小葉長(zhǎng)度；C：甘草小葉寬度；D：甘草頂葉長(zhǎng)度；E：甘草頂葉寬度

由圖1D可知，A與D型頂葉長(zhǎng)度較短，而其他類型的頂葉長(zhǎng)度均較長(zhǎng)。t檢驗(yàn)分析得A與D、A與F、B與C、B與E、C與E、D與F以及E與F型之間P值均大于等于0.05，不具有顯著性差異，其余組間P值均小于0.05，具有顯著性差異。由圖1E可知，A與D型頂葉寬度較窄，而其他類型頂葉寬度均較寬。t檢驗(yàn)可知，A與D（P=0.742）、B與E（P=0.656）、D與F（P=0.09）型間P＞0.05，不存在顯著性差異，其他組間P值均小于0.05，具有顯著性差異。綜合以上對(duì)頂葉長(zhǎng)度及寬度的分析，我們發(fā)現(xiàn)A與D型在頂葉長(zhǎng)度和寬度方面數(shù)值均較小，頂葉的整體面積均小于其他類型；而B(niǎo)與E型在頂葉長(zhǎng)度和寬度方面數(shù)值均較大，頂葉的整體面積均大于其他類型。

2.3 甘草酸含量測(cè)定結(jié)果

將甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)系列各進(jìn)樣10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線形回歸，得到回歸方程y=4969.2x-10.336（R2=0.9994）。

按照前述HPLC方法對(duì)60個(gè)甘草樣品中的甘草酸進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示A～F功能基因CNV組合中，甘草酸平均含量依次為 1.78%±0.28%、3.33%±0.34%、1.89%±0.23%、1.35%±0.30%、2.14%±0.32%和2.04%±0.37%（圖2）。B型的甘草酸含量明顯高于其他類型，而D型的甘草酸含量則明顯低于其他類型。對(duì)6組甘草樣品中甘草酸含量進(jìn)行兩兩比較的顯著性差異分析結(jié)果表明，B型與其他類型之間均具有顯著性差異，其P值均小于0.05，從而證明B型，即β-AS基因與SQS1基因單拷貝、HMGR基因2拷貝的功能基因拷貝數(shù)組合更有利于甘草酸的積累；D型與其他類型之間也均存在顯著性差異，從而證明D型，即β-AS基因與SQS1基因2拷貝、HMGR基因單拷貝的功能基因拷貝數(shù)組合更不利于甘草酸的積累。B與D型在功能基因組合上是恰恰相反的2種類型，其甘草酸含量在6種類型中也分別為最高和最低，這也在一定程度上說(shuō)明功能基因影響次生代謝產(chǎn)物的生物合成。

3 討論

圖2 6種CNV組合類型甘草的甘草酸平均含量

近年來(lái)臨床上對(duì)天然藥物的實(shí)際需求不斷增加，而許多來(lái)源于植物的藥物，如紫杉醇等，仍需要依賴生物來(lái)源，從而引發(fā)資源爭(zhēng)奪以及生態(tài)環(huán)境被破壞。如何實(shí)現(xiàn)藥用植物資源的可持續(xù)發(fā)展，在諸多解決方案中，生物技術(shù)被寄予厚望。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中，由于自然突變的作用，遺傳基因會(huì)發(fā)生不同程度的變異，形成基因多態(tài)性，其中功能基因的多態(tài)性對(duì)于調(diào)控產(chǎn)物的合成具有顯著影響。就藥材而言，其藥用成分的含量高低是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的決定性因素，因此功能基因的多態(tài)性同樣是導(dǎo)致其質(zhì)量差異的分子基礎(chǔ)。所以，近年來(lái)與藥用活性成分生物合成關(guān)系密切的功能基因已成為藥用植物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

甘草是我國(guó)最常用的大宗藥材，近年來(lái)由于過(guò)度采挖，導(dǎo)致野生甘草資源匱乏，栽培甘草已成為商品甘草的主流產(chǎn)品。但栽培甘草中甘草酸的含量普遍偏低，難以達(dá)到藥典規(guī)定的甘草酸含量2.0%的標(biāo)準(zhǔn)。這已成為制約甘草可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。對(duì)影響其次生代謝的功能基因開(kāi)展研究，則有望篩選優(yōu)良基因，從而提高甘草酸的合成與積累。同時(shí)，如果功能基因的改變能夠在表觀特征方面得以清晰的判斷，則可以使得篩選范圍縮小，更易于順利進(jìn)行。

我們從功能基因的拷貝數(shù)多態(tài)性入手，對(duì)來(lái)自7個(gè)產(chǎn)地的60株甘草進(jìn)行了HMGR、SQS1、β-AS基因的拷貝數(shù)測(cè)定，并根據(jù)拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果將60株甘草劃分成6種類型。對(duì)6種類型甘草樣品的葉片形態(tài)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)B型（β-AS+HMGR+SQS1=1+2+1）和E型（2+2+1）在所有的類型中葉片面積較大，而A型（1+1+1）和D型（2+1+2）的葉片面積則較小。HPLC分析結(jié)果顯示6種類型中B型的甘草酸含量最高，平均值為3.33%；E型僅次于B型，其甘草酸含量平均值為2.14%；而A型和D型中甘草酸的含量則相對(duì)較低，特別是D型，其甘草酸平均含量最低，僅為1.35%。因此，β-AS基因與SQS1基因單拷貝、HMGR基因2拷貝的甘草植株，其葉片具有較大的面積，更有利于甘草酸的積累，而β-AS基因與SQS1基因2拷貝、HMGR基因單拷貝的甘草植株，其葉片具有較小的面積，更不利于甘草酸的積累。本研究的結(jié)果將為優(yōu)質(zhì)甘草的篩選奠定基礎(chǔ)。

[1] 曾路，李勝華，樓之岑.國(guó)產(chǎn)甘草的生藥形態(tài)組織學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1988,23(3):200-208.

[2] Liu Y,Zhu X,Li W,et al.Enhancing production of ergoster?ol in Pichia pastoris GS115 by over-expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase from Glycyrrhiza uralensis[J].Acta Pharm Sin B,2014,4(2):161-166.

[3] Liu Y,Xu Q X,Xi P Y,et al.Cloning and characterization of a cDNA coding 3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase involved in glycyrrhizic acid biosynthesis in Glycyrrhiza ura?lensis[J].Acta Pharm Sin,2013,48(5):773-779.

[4] Seo J W,Jeong J H,Shin C G,et al Overexpression of squa?lene synthase in Eleutherococcus senticosus increases phytos?terol and triterpene accumulation[J].Phytochemistry,2005,66:869-877.

[5] Lu H Y,Liu J M,Zhang H C,et al.Ri-mediated transforma?tion of Glycyrrhiza uralensis with a squalene synthase gene(GuSQS1)forproduction ofglycyrrhizin[J].PlantMolBio Rep,2008,26:1-11.

[6] Hayashi H,Huang P,Kirakosyan A,et al.Cloning and char?acterization of a cDNA encoding beta-amyrin synthase in?volved in glycyrrhizin and soyasaponin biosyntheses in lico?rice[J].Biol Pharm Bull,2001,24:912-916.

[7] Cook E H Jr,Scherer S W.Copy-number variations associat?ed with neuropsychiatric conditions[J].Nature,2008,455(7215):919-923.

[8] 劉穎,劉東吉,劉春生,等.基于HMGR,SQS1,β-AS基因CNVs的甘草道地性機(jī)制研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(2):250-255.

[9] 劉穎,劉東吉,劉春生.甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs檢測(cè)體系的建立[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(3):283-287.

[10]陳學(xué)軍,程志芳,陳勁楓,等.辣椒種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD和ISSR及其表型數(shù)據(jù)分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2007,27(4):662-670.

[11]劉東吉.甘草HMGR,SQS,β-AS合酶基因CNVs與產(chǎn)地,形態(tài)的相關(guān)性研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2011:8-11.

[12]中華人民共和國(guó)藥典（I部）[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:80-81.