重組人B7-H1 IgV疫苗的初步毒理學(xué)研究

曹正聰，張存，吳守振，張旺倩，張英起，張偉

1.腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

2.第四軍醫(yī)大學(xué) a.藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；b.學(xué)員一旅四營十四連；陜西 西安 710032

B7-H1是共刺激分子B7家族成員，在正常組織中幾乎不表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)[1-3]。在外周組織，腫瘤細(xì)胞表面的B7-H1能誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL凋亡，從而抑制機(jī)體對腫瘤的免疫反應(yīng)；而在淋巴器官內(nèi)，抗原呈遞細(xì)胞表面的B7-H1與初始T淋巴細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的無能[4-5]。因此，理論上，B7-H1既可以作為一種腫瘤抗原，又是參與腫瘤免疫逃逸的重要分子；阻斷B7-H1，既能直接抑制腫瘤的生長，又能抑制腫瘤的免疫逃避，提高初始T細(xì)胞的激活能力和CTL殺傷活性，從而提高其他抗原的免疫反應(yīng)[6]。

我們課題組一直致力于B7-H1阻斷劑的研究，前期用基因工程方法表達(dá)并純化了重組人B7-H1（rhB7-H1）IgV融合蛋白疫苗，已經(jīng)完成了工程菌菌種的鑒定和中試發(fā)酵純化工藝；相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明該疫苗能夠有效抑制B7-H1陽性的腫瘤的生長，并且能夠延長荷瘤動物的生存期[7-10]。

為了進(jìn)行系統(tǒng)的臨床前研究，我們對疫苗進(jìn)行了初步毒理學(xué)研究。我們采用與之前實(shí)驗(yàn)相同工藝制備的rhB7-H1 IgV疫苗、一致的實(shí)驗(yàn)動物（BALB/c小鼠）和免疫流程，考察了疫苗的安全性。分別觀察了各組疫苗免疫組小鼠的進(jìn)食、體重等一般狀況，血液學(xué)和血清生化學(xué)指標(biāo)，重要臟器組織的大體病理學(xué)、組織病理學(xué)情況及相對重量，CD4+/CD8+T細(xì)胞百分率和比值。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，15～18 g）購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；FITC-CD4、PE-CD8單克隆抗體及相應(yīng)的同型對照購自Biolend公司；酵母抽提物為Oxide公司產(chǎn)品；Tris base為Promega公司產(chǎn)品；IPTG為Solon公司產(chǎn)品；TEMED購于Bio-Rad公司；咪唑購于北京鼎國生物公司；丙烯酰胺、N，N'-二甲基雙丙烯酰胺、SDS、過硫酸銨、氯化鈣、甘油等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 小鼠的分組與免疫

30只BALB/c小鼠按體重隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為生理鹽水對照組、佐劑對照組（氫氧化鋁佐劑）、B7-H1組（B7-H1+氫氧化鋁佐劑）。免疫方法及流程見參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 小鼠的一般情況監(jiān)測

入組時各組小鼠體重一致，無統(tǒng)計學(xué)差異。于第0、2、4、6、8、10周分別稱量體重一次，觀察各免疫組小鼠體重是否有變化。在飼養(yǎng)過程中，觀察小鼠的進(jìn)食、毛色、活動等生活狀態(tài)。

1.4 臨床病理學(xué)檢查

包括血液學(xué)和血清生化學(xué)檢查。免疫4次后2周于小鼠眼球取血，取血前禁食過夜。血液學(xué)檢查用血用EDTA抗凝后，采用ADVIA 120血液學(xué)檢查系統(tǒng)進(jìn)行檢測；血清生化學(xué)檢查用血直接分離血清，采用全自動生化分析儀進(jìn)行測定。

1.5 組織病理學(xué)檢查

免疫4次后2周，對各組小鼠采血、放血，剖檢動物，對心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺等主要組織、臟器和免疫系統(tǒng)相關(guān)組織器官進(jìn)行大體病理學(xué)檢查并稱重；同時，保存并固定指定的組織臟器，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.6 小鼠脾CD4+和CD8+T細(xì)胞計數(shù)

從制備好的脾細(xì)胞中取1×106細(xì)胞，用約1 mL FACS洗液洗滌，1500 r/min離心5 min，棄上清，輕彈管底混勻細(xì)胞，加入40 μL FACS洗液重懸細(xì)胞；將FITC-CD4、PE-CD8單克隆抗體各1 μL加入8 μL FACS洗液中，將抗體溶液加入40 μL上述脾細(xì)胞懸液中，冰上避光作用30 min；加1 mL FACS洗液，3000 r/min離心5 min洗滌，棄上清；加500 μL FACS洗液重懸，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)濾至圓底流式測定管中，于4℃儲存或直接上FACS Callibur流式細(xì)胞儀檢測，統(tǒng)計分析CD4+和CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例，并計算二者的比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析，采用Dunnett's test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況監(jiān)測結(jié)果

3個組別30只動物，從免疫開始至恢復(fù)期結(jié)束，無嚴(yán)重的動物爭斗、撕咬及死亡，極少數(shù)動物因爭斗有輕微外傷但很快恢復(fù)。各組攝食量在給藥期間和恢復(fù)期基本無顯著差異；其他動物臨床表現(xiàn)無異常。各組在整個免疫期間體重基本保持增長趨勢（圖1）；B7-H1組、佐劑對照組與生理鹽水對照組的小鼠體重?zé)o明顯差異（表1）。

2.2 臨床病理學(xué)檢查

免疫4次后取血，血清生化學(xué)分析結(jié)果表明，B7-H1組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平和血糖（GLU）水平（P＜0.05）與生理鹽水對照組比較稍有升高；氫氧化鋁佐劑組的白蛋白（ALB）水平明顯低于生理鹽水對照組（P＜0.01）；上述變化值均在該種鼠動物的正常值范圍內(nèi)；其他各項血清生化指標(biāo)與生理鹽水對照組比較基本無顯著差異。結(jié)果見表2。

免疫4次后，B7-H1組與佐劑組的白細(xì)胞（WBC）水平與生理鹽水對照組比較無顯著性差異，說明小鼠飼養(yǎng)規(guī)范，無感染；B7-H1組的淋巴細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞百分比與生理鹽水對照組比較稍有降低（P＜0.05），但上述變化在該種鼠動物的正常值范圍內(nèi)；其他各項指標(biāo)未見明顯異常。結(jié)果見表3。

圖1 BALB/c小鼠免疫期間體重的變化

表1 BALB/c小鼠免疫期間體重的變化（g，x±s，n=8）

2.3 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

免疫4次后，解剖小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺各臟器，肉眼觀察各組無明顯形態(tài)、大小的差異和異常。各臟器稱重結(jié)果顯示，佐劑對照組小鼠的脾臟相對重量與生理鹽水對照組比較降低（P＜0.05）；其他各組各臟器相對重量與生理鹽水對照組比較均無顯著差異。結(jié)果見表4。將各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺臟器用福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色觀察分析，結(jié)果顯示，4次免疫后，各免疫組小鼠臟器與對照組相比，沒有出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)病變（圖2）。

2.4 小鼠脾CD4+和CD8+T細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

免疫4次后，各組小鼠取取脾檢測CD4＋和CD8＋T細(xì)胞百分率，結(jié)果表明，單純佐劑組和B7-H1組與生理鹽水對照組相比，CD4＋T細(xì)胞細(xì)胞百分率及兩者比例均有所增高；尤其是B7-H1組CD4＋T細(xì)胞百分率顯著增高（P＜0.01），可能均誘導(dǎo)產(chǎn)生了不同程度的炎性免疫反應(yīng)（表5）。

3 討論

疫苗可分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗。傳統(tǒng)疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗，多采用病毒微生物及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)人工減毒、脫毒、滅活等方法制成[11]。由于制作工藝的限制，在保存、使用和接種副反應(yīng)等方面都容易出現(xiàn)問題。新型疫苗是利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，包括單克隆抗體技術(shù)、基因工程技術(shù)和生物合成技術(shù)等研制的抗獨(dú)特型抗體疫苗、基因工程疫苗和合成多肽疫苗等，其中基因工程疫苗占主導(dǎo)地位[12]。疫苗具有獨(dú)特的、多樣的結(jié)構(gòu)及生物活性，有種屬特異性、免疫原性、不可預(yù)測的多效性。在理論上，疫苗可能導(dǎo)致的毒性反應(yīng)主要包括制品成分本身作為毒性物質(zhì)對機(jī)體的直接損傷、誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)引起的與免疫相關(guān)的毒性、污染物和殘余雜質(zhì)引起的毒性。由于疫苗通過誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體及/或效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮作用，其最主要的潛在毒性來自與免疫系統(tǒng)相關(guān)的毒性，主要包括免疫抑制、免疫刺激、超敏反應(yīng)、自身免疫[13]。

表2 BALB/c小鼠免疫4次后2周血清生化指標(biāo)的變化（x±s）

表3 BALB/c小鼠免疫4次后2周血液學(xué)指標(biāo)的變化（x±s）

表4 BALB/c小鼠免疫4次后2周臟器相對重量的變化（g/100 g體重，x±s）

圖2 各組重要臟器的HE染色結(jié)果

表5 BALB/c小鼠免疫4次后2周CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例的變化（x±s）

本研究中，我們針對重組人B7-H1 IgV疫苗的特點(diǎn)設(shè)計獨(dú)特的毒理學(xué)研究方案，充分考慮了佐劑的影響。在一般毒理學(xué)指標(biāo)方面，除個別血液學(xué)指標(biāo)外，疫苗及其所使用的氫氧化鋁佐劑對一般毒理學(xué)指標(biāo)未見顯著性影響。在免疫毒理方面，疫苗免疫過程中，會引起CD4+T淋巴細(xì)胞的升高而CD8+T細(xì)胞則無明顯波動，這一方面提示B7-H1疫苗可能確實(shí)誘導(dǎo)了高滴度的體液免疫反應(yīng)但未引起有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)，與我們之前的結(jié)果一致；另一方面由于佐劑也誘導(dǎo)了CD4+T淋巴細(xì)胞的升高，所以也有一部分是由于誘導(dǎo)了炎性免疫反應(yīng)。但從總體上看，疫苗對T淋巴細(xì)胞相對數(shù)量和比例的影響不大，沒有出現(xiàn)比例倒置等現(xiàn)象?？傊?，該研究對我們課題組進(jìn)一步設(shè)計系統(tǒng)的重組人B7-H1 IgV疫苗的臨床前實(shí)驗(yàn)提供了重要的參考依據(jù)。

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