固相萃取-超高效液相色譜法檢測(cè)地表水中7種氯酚類化合物

陳建華，彭剛?cè)A，喬支衛(wèi)，張振欣，吳志強(qiáng)

江西省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，江西 南昌 330039

氯酚類化合物(CPs)是一類毒性強(qiáng)、難分解的氯代芳香族有機(jī)污染物，對(duì)人、畜均有較大毒性，其中五氯酚被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC列為第2B組致癌物［1］。中國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)中規(guī)定2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚和五氯酚的濃度限值，分別為 0.093、0.2、0.009 mg/L［2］。

水體中氯酚類化合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜 法［3-5］、液 相 色 譜 紫 外 法［6-9］、液-質(zhì) 聯(lián) 用法［10-14］。

目前，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的氯酚類檢測(cè)方法均為液液萃取衍生化氣相色譜法，液液萃取法雖然具有較好的回收率，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、萃取液易乳化和有機(jī)試劑用量較大等諸多不足;同時(shí)衍生化過(guò)程操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)，而且會(huì)降低檢測(cè)重現(xiàn)性和靈敏度。另外，相關(guān)檢測(cè)方法都只有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了限值的2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚3種化合物，并未對(duì)其他有害氯酚類化合物進(jìn)行分析。在此背景下，本研究建立了固相萃取-超高效液相色譜法同時(shí)分析水體中7種氯酚類化合物的檢測(cè)方法，包括4-氯酚、2，4-二氯酚、2，6-二氯酚、2，4，5-三氯酚、2，4，6-三氯酚、2，3，4，6-四氯酚、五氯酚，能夠滿足地表水的實(shí)際檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品采集與保存

地表水采樣選用棕色玻璃瓶罐裝，采樣時(shí)水樣應(yīng)充滿采樣瓶并加蓋密封，防止空氣進(jìn)入，樣品在4℃下避光保存。

1.2 儀器與試劑

儀器:配有四元梯度泵和光電二級(jí)陣列管檢測(cè)器(PDAD)的超高效液相色譜儀(Waters ACQUITY UPLC H-Class)、液相色譜柱(Waters ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm，2.1 × 100 μm，186002350)、固相萃取小柱(Waters Oasis HLB，200 mg/6 mL)、自動(dòng)固相萃取儀(Auto SPE-06c)、pH計(jì)(pHS-430)、溶劑過(guò)濾裝置(T-50)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000E)、有機(jī)相濾頭(ANPEL，SCAA-104，13 mm，0.22 μm)。

試劑和水:甲醇、二氯甲烷、丙酮均為色譜純級(jí)，乙酸、硫酸均為優(yōu)純級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品:氯酚標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó) Accustandart公司:Chlorinated Phenolics-Mix A，0.1 mg/mL in MeOH，210081058-01)，濃度為100 mg/L。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

依次移取 10、30、50、70、100 μL 氯酚標(biāo)液于棕色進(jìn)樣瓶中，用60%甲醇水溶液定容至1.0 mL，得到 1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mg/L 氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品前處理

水樣若為飲用水須先用硫代硫酸鈉除去余氯，地表水用定量濾紙過(guò)濾，工業(yè)廢水濃度過(guò)高時(shí)可以適當(dāng)稀釋后過(guò)濾。量取1 000 mL水樣，用硫酸調(diào)節(jié)pH為1.5～3，以pH=2為最宜。

固相萃取柱先依次用5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL超純水以5 mL/min流速活化平衡，1 000 mL水樣以10 mL/min流速通過(guò)萃取柱，再依次用5 mL丙酮、10 mL二氯甲烷分別以5 mL/min流速洗脫，洗脫液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋蒸至近干后用60%甲醇水定容至1.0 mL。

1.5 樣品分析

進(jìn)樣體積為 5 μL，流速為 0.3 mL/min，色譜柱為 BEH C18(1.7 μm，2.1 × 100 μm)，柱溫為30℃，樣品溫度為4℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為分段檢測(cè)(表1)，流動(dòng)相為甲醇-水(含0.2%乙酸)，梯度變化見(jiàn)表2。色譜圖如圖1所示。

表1 不同氯酚類化合物最大吸收波長(zhǎng)及其檢測(cè)波長(zhǎng)程序設(shè)定

表2 超高效液相色譜法檢測(cè)氯酚類化合物的流動(dòng)相洗脫程序設(shè)定

圖1 超高效液相色譜法檢測(cè)氯酚類化合物色譜圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相選擇

張冬梅等［8］比較了使用甲醇-水和乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)氯酚類化合物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-水作流動(dòng)相峰形較好，且干擾少、分離效果更佳。蘇燕、薛鳳麗等［7，15］在甲醇-水流動(dòng)相中加入少量乙酸后，能夠抑制氯酚類的電離，進(jìn)一步改善峰形，增加檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)。李曉晶、廖林川等［13，16］比較了在流動(dòng)相中添加甲酸、乙酸銨、甲酸銨-甲酸對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明，添加乙酸銨后峰形變好，保留時(shí)間不再漂移且能夠與雜質(zhì)完全分離。

選擇甲醇-水作為流動(dòng)相，比較了向流動(dòng)相中添加乙酸和乙酸銨的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含乙酸銨的流動(dòng)相雖然出峰時(shí)間較短，但是峰形較差，分離度也不夠好。最終選擇甲醇-水(含0.2%乙酸)為流動(dòng)相，峰形尖銳、分離度良好，且樣品能夠與干擾物分開(kāi)。

2.2 色譜柱和柱溫的選擇

色譜柱性能會(huì)影響目標(biāo)化合物的分離效果、峰形、分析時(shí)間、穩(wěn)定性等。選用第二代雜化顆粒技術(shù)的 Waters BEH C18色譜柱(2.1 ×100 μm，1.7 μm)，與常規(guī)C18色譜柱相比，BEH C18柱內(nèi)徑和填料顆粒粒徑更小，死體積小，具有柱效高、pH耐受范圍寬、穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，同時(shí)目標(biāo)化合物分離峰形更好，分析時(shí)間也更短。

柱溫直接影響氯酚類化合物在色譜柱上的吸附和解析時(shí)間，從而影響色譜峰的保留時(shí)間和分離效果。對(duì)不同柱溫(25、30、35、40℃)條件下氯酚類化合物的分離效果相比較，表明不同溫度對(duì)氯酚類化合物的響應(yīng)和分離度影響較小，保留時(shí)間隨柱溫的升高略微前移。綜合考慮，色譜柱溫度選擇為30℃。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

氯酚類化合物含有苯環(huán)，具有較強(qiáng)的紫外吸收，可以用紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。通過(guò)利用二級(jí)陣列管紫外檢測(cè)器對(duì)7種氯酚化合物在190～400 nm間進(jìn)行全掃描，得到3D光譜圖和各化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)。為提高各化合物的檢測(cè)靈敏度，降低檢出限，采用波長(zhǎng)分段檢測(cè)模式，0 ～5 min 內(nèi)檢測(cè) 4-氯酚、2，4-二氯酚、2，6-二氯酚，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為285 nm;5～7.5 min內(nèi)檢測(cè) 2，4，5-三氯酚、2，4，6-三氯酚，波長(zhǎng)設(shè)定為 290 nm;7.5 ～10 min 內(nèi)檢測(cè) 2，3，4，6-四氯酚，波長(zhǎng)設(shè)定為300 nm，10～15 min內(nèi)檢測(cè)五氯酚，波長(zhǎng)設(shè)定為304 nm。

2.4 萃取條件的優(yōu)化

樣品前處理方法采用固相萃取法，既操作簡(jiǎn)單、快速，又可實(shí)現(xiàn)無(wú)相分離避免乳化現(xiàn)象，減少溶劑使用量。

2.4.1 萃取柱的選擇

陳硏朦等［10］研究了 Waters HLB(6 mL，200 mg)、MCX(3 mL，60 mg)兩種萃取柱的回收率，資料表明，HLB 對(duì) 2，4，6-三氯酚、五氯酚的回收率為70% ～100%，明顯高于 MCX的回收率(30% ～ 60%)。楊秋紅等［12］對(duì) ODS-C18、ENVI、HLB進(jìn)行的比較研究表明，3種萃取柱的回收率大小依次為HLB＞ENVI＞ODS-C18。

綜上分析，本實(shí)驗(yàn)選擇Waters HLB(6 mL，200 mg)萃取柱，可保證更好的回收率和重現(xiàn)性。

2.4.2 萃取溶劑的選擇

楊秋紅等［12］分別對(duì)甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮、二氯甲烷-丙酮(1+1)等萃取溶劑的洗脫能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，結(jié)果表明，二氯甲烷/丙酮(1+1)對(duì)氯酚的洗脫能力最強(qiáng)，回收率最好。

選擇二氯甲烷、丙酮為萃取溶劑，先用二氯甲烷洗去萃取柱中可能存在的能溶于二氯甲烷中的物質(zhì)，再依次用甲醇、水活化平衡萃取柱;由于水和二氯甲烷極性相差較大，兩者不互溶，水樣進(jìn)樣后先用空氣推出管路中殘留水樣，氮?dú)獯蹈奢腿≈?，再用極性中等的丙酮溶劑(與水和二氯甲烷均能互溶)洗脫，最后用二氯甲烷洗脫。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，依次使用丙酮、二氯甲烷相比只用二氯甲烷溶劑洗脫萃取柱，氯酚類化合物的萃取回收率明顯提高，且重復(fù)性也更好。

2.4.3 水樣pH的調(diào)節(jié)

氯酚類化合物略呈酸性，在水中常以氯酚鈉鹽的形式存在，為了提高氯酚類在萃取柱上的吸附和保留，往往需要在水樣中加入酸使其轉(zhuǎn)化為氯酚類化合物。由于7種氯酚類的PKa值相差較大，在水中電離程度也就不一樣，實(shí)驗(yàn)中用硫酸將水樣 pH分別調(diào)至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，測(cè)定不同pH的氯酚類化合物的回收率，見(jiàn)圖2。

實(shí)驗(yàn)表明，2，3，4，5-四氯酚、五氯酚回收率受pH(1.5～4.0)變化的影響不大，回收率保持在78% ～87%;4-氯酚、2，6-二氯酚、2，4-二氯酚、2，4，5-三氯酚在pH≤3時(shí)回收率較穩(wěn)定，但當(dāng)pH＞3時(shí)回收率明顯降低;2，4，6-三氯酚受pH影響較大，回收率隨pH增加而逐漸下降。綜上所述，調(diào)節(jié)水樣pH為1.5～3.0時(shí)回收率較好，其中pH=2最為適宜，各氯酚類化合物的回收率都在80%以上。

圖2 各氯酚類化合物在不同pH時(shí)回收率變化情況

2.5 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限

配制 1、3、5、7、10 mg/L 的氯酚類化合物混合標(biāo)液，得到各氯酚類化合物不同濃度響應(yīng)值，通過(guò)線性方程擬合，其標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)表明，各氯酚化合物濃度為1～10 mg/L具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)＞0.999 7;當(dāng)萃取體積為1 L，濃縮至1 mL，進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，7種氯酚的方法檢出限為12.7～32.1 ng/L，測(cè)定下限為50.8～128.4 ng/L，能夠達(dá)到目前氯酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)方法的同等水平。

表3 各氯酚類化合物的線性方程和方法檢出限

2.6 方法準(zhǔn)確度和精密度

在空白水樣中分別添加高低兩組濃度水平的氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組平行樣品5份，按照上述前處理和樣品分析方法，測(cè)得加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表4所示。

低濃度組(1 μg/L)平均加標(biāo)回收率為81.1% ～108.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.6% ～13.3%;高濃度組(5 μg/L)平均加標(biāo)回收率為79.2%～90.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1% ～ 12.0%。

表4 各氯酚類化合物的加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

高、低濃度水平的加標(biāo)樣品各隨機(jī)選取1個(gè)，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，一周后再分別重復(fù)進(jìn)樣6次，各氯酚類化合物的精密度及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表5所示。

表5 各氯酚類化合物的精確度及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.7 實(shí)際水樣測(cè)定

對(duì)江西省6個(gè)地級(jí)市自來(lái)水廠取水口(A～F)水樣中氯酚類化合物的檢測(cè)。樣品于2014年4月初采集后立即帶回實(shí)驗(yàn)室分析，如表6所示，取水口處地表水均不同程度受到氯酚類化合物的污染，污染物為 4-氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚，濃度范圍分別為 ND ～0.101 μg/L、0.219～0.445 μg/L、ND ～ 0.181 μg/L。《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)規(guī)定，2，4，6-三氯酚、五氯酚的限值分別為0.2、0.009 mg/L，參照該標(biāo)準(zhǔn)，表明實(shí)測(cè)水樣中氯酚類化合物含量較低，濃度遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定限值。

表6 集中式生活飲用水地表水源地水、地下水和工業(yè)廢水中氯酚類化合物檢測(cè)結(jié)果 μg/L

該方法同時(shí)應(yīng)用于地下水和工業(yè)廢水中氯酚類化合物的檢測(cè)，結(jié)果表明，地下水中未檢測(cè)到氯酚類化合物，工業(yè)廢水中檢出2，4二氯酚、2，4，6-三氯酚，濃度分別為 0.158、0.148 μg/L;由于樣品基數(shù)少，加上工業(yè)廢水成分復(fù)雜多變，能否應(yīng)用于地下水和工業(yè)廢水檢測(cè)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論

用固相萃取法富集水樣，以丙酮和二氯甲烷為洗脫液，甲醇-水溶液(含0.2%乙酸)為流動(dòng)相的固相萃取-超高效液相色譜法，能夠同時(shí)檢測(cè)水體中7種氯酚類化合物，具有良好的線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度、精密度。當(dāng)萃取體積為1 L，濃縮至1 mL，進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，方法檢出限為12.7～32.1 ng/L，測(cè)定下限為 50.8 ～128.4 ng/L，平均加標(biāo)回收率為79.2% ～108.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～13.3%。

該方法適用于地表水中氯酚類化合物的檢測(cè)，具有一定的應(yīng)用和推廣價(jià)值;對(duì)2014年4月江西省6個(gè)地級(jí)城市集中式生活飲用水地表水源地水樣中的氯酚類化合物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，水源地地表水中有檢出氯酚類化合物，但其含量很低，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定限值。

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