一株產(chǎn)殼聚糖酶海洋真菌MF-08的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

李佳茵，王慧敏，祖國仁

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

一株產(chǎn)殼聚糖酶海洋真菌MF-08的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

李佳茵，王慧敏，祖國仁*

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

從實(shí)驗(yàn)室保存的海洋產(chǎn)殼聚糖酶真菌中分離純化出一株產(chǎn)殼聚糖酶活性較高的菌株，命名為MF-08。通過26S rDNA序列分析并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，將海洋真菌MF-08歸為黃曲霉群。殼聚糖酶的最適作用溫度為40℃；最適反應(yīng)pH為5.2；酶活在pH4.0～6.0和小于40℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定；Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋對殼聚糖酶活性有明顯的抑制作用。

海洋真菌MF-08，殼聚糖酶，26S rDNA

殼聚糖是甲殼素脫乙酰后的產(chǎn)物，是自然界中唯一天然存在的陽離子聚合物[1]。殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，是目前僅知的唯一的堿性寡糖，具有獨(dú)特的生物活性。由于殼寡糖與生物體細(xì)胞具有良好的生物兼容性，無毒性、環(huán)境友好型、易被生物體分解等許多特殊的理化性質(zhì)，被廣泛地應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。尤其是在醫(yī)藥和食品方面，殼寡糖具有提高食品質(zhì)量和人體健康的重要功效。制備殼寡糖的方式主要有物理降解法、化學(xué)降解法和生物降解法（主要指酶法降解）[2]。殼聚糖酶是水解殼聚糖制備殼寡糖的專一性水解酶之一[3]。酶法降解易于控制過程和產(chǎn)物質(zhì)量分布，且不造成環(huán)境的污染。為微生物工業(yè)化轉(zhuǎn)化殼聚糖提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前已從多種微生物中分離出殼聚糖酶，大部分以細(xì)菌為出發(fā)菌，而且酶活相對并不是很高，殼聚糖酶實(shí)現(xiàn)商業(yè)化發(fā)展就比較困難。以從海洋中篩選分離出來的真菌為出發(fā)菌株的報(bào)道不是很多，提高其產(chǎn)殼聚糖酶的酶活性，為開發(fā)海洋資源提供重要依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究一株從實(shí)驗(yàn)室保存的海洋產(chǎn)殼聚糖酶真菌中分離純化出的產(chǎn)殼聚糖酶活性較高的菌株。通過形態(tài)學(xué)觀察及26S rDNA序列進(jìn)行了初步鑒定。并對其產(chǎn)酶特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋真菌MF-08 大連工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋 上海博訊儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋、DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、MJP-150型霉菌培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；雙層小容量全溫度恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；722s分光光度計(jì) 上海精密儀器科學(xué)有限公司；TGL-16C型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 培養(yǎng)基

試管斜面培養(yǎng)基：1.0%葡萄糖，0.5%殼聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸餾水，60%陳海水，2%瓊脂，115～120℃，滅菌20 min，冷卻待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%；FePO40.01%；陳海水100 mL；pH7.6；在115～121℃滅菌20 min，冷卻待用。

平板分離培養(yǎng)基：1.0%膠體殼聚糖，0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，2%瓊脂，100 mL陳海水，115～120℃，滅菌20 min，冷卻待用。

改良的PDA培養(yǎng)基：將馬鈴薯洗凈，去皮，切成2 cm2的小塊備用。取20 g放入燒杯中，加入100 mL陳海水，煮沸30 min，用玻璃棒攪拌以防糊底。用雙層紗布過濾，取其濾液，補(bǔ)足海水，加入0.5%殼聚糖和1%蔗糖，在115～121℃滅菌20 min，冷卻待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液的制備 從保藏的試管斜面挑取孢子于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)72 h，取一定量發(fā)酵液，8000 r/min離心15 min，其上清液即為粗酶液[3]。

1.3.2 酶活力測定方法 1 mL含殼聚糖0.5%（0.5 g/100 mL）的乙酸緩沖液，加入1 mL粗酶液，37℃下保溫30 min，煮沸5 min終止酶反應(yīng)[4]。DNS法測定還原糖[5]。

酶活性（U/mL）＝m×N×1000/（M×T×V）

其中：m：還原糖量（mg）；N：稀釋倍數(shù)；M：還原糖分子量（氨基葡萄糖C6H13O5N分子量）；T：反應(yīng)時(shí)間（30 min）；V：酶液體積（1 mL）。

相對酶活：以同組實(shí)驗(yàn)的最高酶活性值為1，其他酶活性與最高酶活的比值。

剩余酶活（%）：經(jīng)過一定處理后此時(shí)的酶活/原來的酶活。

1.3.3 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的分離純化 對本實(shí)驗(yàn)室冷藏保存的20支菌種分別進(jìn)行平板梯度稀釋，于27℃恒溫培養(yǎng)120 h，挑選生長情況較好的、有明顯透明圈的菌株。用平板分離培養(yǎng)基分離得到的活性較高的菌株，搖瓶發(fā)酵，用DNS法測酶活力，選取一株酶活力最高的菌株作為出發(fā)菌株[5]。將篩選出的菌株接入試管斜面培養(yǎng)基，冷藏保存。

1.3.4 海洋真菌MF-08的形態(tài)學(xué)鑒定 三點(diǎn)培養(yǎng)——菌落形態(tài)觀察：用滅菌牙簽沾取少量孢子在平板分離培養(yǎng)基上呈等邊三角形的點(diǎn)三個(gè)點(diǎn)，倒置于27℃的霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察其逐漸變化。

小室培養(yǎng)——個(gè)體形態(tài)觀察：挑取少量海洋真菌MF-08的孢子于有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的載玻片上，置于27℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后于顯微鏡下觀察。

大培養(yǎng)——個(gè)體形態(tài)觀察：將生長有菌落的培養(yǎng)皿去除皿蓋置于顯微鏡的載物臺上，用低倍鏡觀察其生長情況。

制片觀察——菌落形態(tài)觀察：在干凈的載玻片上加一滴乳酸-苯酚固定液，用三棱針挑取已培養(yǎng)好的菌株MF-08置于其中，40倍光學(xué)顯微鏡下觀察[6]。

根據(jù)霉菌菌落及個(gè)體形態(tài)觀察，鑒定出霉菌菌屬。根據(jù)霉菌形態(tài)基本鑒定方法結(jié)合《食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊》[7]鑒定出霉菌菌種。

1.3.5 26S rDNA擴(kuò)增與序列分析 26S rDNA的D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增的通用引物NL1：5’-GCATATCAATAAG CGGAGGAAAAG-3’；NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAA GACGG-3’進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL：上述1的變形反應(yīng)液1μL，PCR Premix 25μL，D1/D2 Forward primer（20pmol/μL）0.5 μL，D1/D2 Reverse primer（20pmol/μL）0.5 μL，dH2O 23μL。PCR過程：94℃，5 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）×30個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測回收，并送交測序公司測序。

1.3.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast比對，采用Mega 3.1軟件的鄰接法構(gòu)建該海洋真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 酶學(xué)性質(zhì)的研究方法

1.3.7.1 最適反應(yīng)溫度 將酶促反應(yīng)體系的溫度分別設(shè)定為30、35、40、45、50、55、60、70、80℃，按照1.3.2的方法測酶活。

1.3.7.2 殼聚糖酶溫度穩(wěn)定性 將殼聚糖酶的粗酶液分別置于30、40、45、50、60℃恒溫水浴鍋中保溫10、20、30、40、80、120 min，然后按照1.3.2的方法測剩余酶活力。

1.3.7.3 最適反應(yīng)pH 用pH分別為4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6和5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5%殼聚糖底物溶液代替酶活力測定中的pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和0.5%殼聚糖底物溶液，按照1.3.2的方法測酶活。

1.3.7.4 殼聚糖酶pH穩(wěn)定性 將粗酶液與不同pH的廣泛緩沖以1∶1體積比混合，在4℃下放置6 h，測剩余酶活。

1.3.7.5 金屬離子對殼聚糖酶活性的影響 分別向粗酶液加入5 mmol/mL Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋、Cu2＋、Zn2＋和Cu2＋，4℃靜置10 min后，測酶活。以不加金屬離子的酶液的酶活為參照。

1.3.8 方差分析數(shù)據(jù)處理方法 利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的分離純化

將本實(shí)驗(yàn)室保藏的海洋產(chǎn)真菌按照1.3.3中所述的方法進(jìn)行分離純化，從中選取生長速度較快，酶活力最高是一株海洋真菌MF-08作為實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。如圖1為海洋真菌MF-08在平板分離培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生的菌落透明圈形態(tài)照片。

圖1 菌株的菌落和透明圈Fig.1 Strain colony with transparent cricle

2.2 海洋真菌MF-08的鑒定

2.2.1 海洋真菌MF-08的菌落形態(tài)觀察 用三點(diǎn)培養(yǎng)法將海洋真菌MF-08用滅菌牙簽接于平板分離培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)變化見圖2。

圖2 MF-08的菌落形態(tài)Fig.2 The colony morph of MF-08 on plate

由圖2可知，菌落呈圓形酥松放射狀，扁平完整，無浸出液，無光澤。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顏色變化為：白點(diǎn)→變黃→變綠。

2.2.2 海洋真菌MF-08的個(gè)體形態(tài)觀察

2.2.2.1 小室培養(yǎng) 根據(jù)1.3.4中小室培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)并觀察，結(jié)果見圖3。

圖3 海洋霉菌N-8小室培養(yǎng)鏡下形態(tài)Fig.3 Microscopic morph of marine mold N-8 in cell culture inserts

2.2.2.2 制片觀察 根據(jù)1.3.4中制片觀察的方法進(jìn)行培養(yǎng)并觀察，結(jié)果見圖4。

圖4 海洋霉菌N-8制片觀察鏡下形態(tài)Fig.5 Microscopic morph of marine mold N-8 on slide glass

2.2.2.3 大培養(yǎng) 根據(jù)1.3.4中大培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)并觀察，結(jié)果見圖5。

圖5 海洋霉菌N-8大培養(yǎng)鏡下形態(tài)Fig.5 Microscopic morph of marine mold N-8 on plate culture

2.2.3 海洋真菌MF-08的形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)，參照《食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊》[7]曲霉菌屬檢測表，發(fā)現(xiàn)分生孢子頭在發(fā)育過程中出現(xiàn)一些綠色，頂囊不是棒形，小梗單層或兩層。分生孢子頭幼期呈現(xiàn)鮮明的黃、綠色，有時(shí)老后變成褐色，酥松放射狀，全部頂囊著生小梗，小梗雙層。所以初步鑒定為海洋真菌MF-08群。

2.2.4 26S rDNA擴(kuò)增與序列分析 菌株MF-08的PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖6。

圖6 海洋真菌MF-08的26S rDNA 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.6 3%agarose gel electrophoresis analysis of 26S rDNA

擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小為594 bp，將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast（Basic Local Alignment Search Tool）比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該海洋真菌MF-08的26S rDNA部分序列與曲霉屬（Aspergillus sp.）的26S rDNA序列同源性達(dá)100%，由此可知，該海洋產(chǎn)殼聚糖酶真菌為曲霉屬。

2.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用Mega 3.1軟件的鄰接法構(gòu)建海洋真菌MF-08的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖7。

如圖7可知，海洋真菌MF-08與Aspergillus flavus（EF661564.1）和Aspergillus flavus（EF661566.1）聚在一起。故海洋真菌FM-08屬于黃曲霉群（Aspergillus flavus）。

綜合2.2.3的形態(tài)學(xué)鑒定和海洋真菌MF-08的26S rDNA序列同源性比較結(jié)果可知，海洋真菌MF-08為黃曲霉群（Aspergillus flavus）。

2.3 殼聚糖酶部分酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 殼聚糖酶反應(yīng)的最適溫度 在不同溫度下測定海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的活力，結(jié)果見圖8。

溫度是影響酶活性和穩(wěn)定性的重要因素，該殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性是判斷其應(yīng)用價(jià)值的重要考察指標(biāo)。從圖8可以看出，反應(yīng)溫度在40℃以下時(shí)，殼聚糖酶活力隨著溫度的升高而增加，40℃時(shí)酶活性最高，反應(yīng)溫度高于40℃后，酶活力隨之降低。所以最適反應(yīng)溫度為40℃，與Katsuaki Hirano[8]研究結(jié)果相近。而王艷君[9]、閻賀靜等[10]所研究菌株的殼聚糖酶的最適溫度為55℃，袁建平等[11]所研究的為45℃。

圖7 海洋真菌MF-08與相關(guān)菌株序列的26S rDNA基因序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree showing the relationships of marine fungus MF-08 with the sequence of relating type genera constructed by the neighour-joining method and based on 26S rDNA gene sequences

圖8 溫度對殼聚糖酶活性的影響Fig.8 Effect of temperature on chitosanase activity

2.3.2 溫度對殼聚糖穩(wěn)定性的影響 殼聚糖酶在不同溫度下保溫10 min后，測得的剩余酶活見圖9。

圖9 溫度對殼聚糖穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the stability of chitosanase

如圖9可知，在45℃以下，剩余酶活力可保持85%以上，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，酶活力急劇下降，55℃保溫10 min后，剩余酶活力為50%，60℃以上保溫10 min后，酶活力基本完全喪失。

該殼聚糖酶在30、40、50、60℃下放置不同時(shí)間后測得的剩余酶活力見圖10。

圖10 不同溫度下殼聚糖酶在不同時(shí)間內(nèi)的對熱穩(wěn)定性Fig.10 Effect of time on the stability of chitosanase under different temperature

從圖10可知，40℃下隨放置時(shí)間的延長，酶活力有一定的損失，60 min后剩余酶活力為70%，而30℃下放置的酶活力基本穩(wěn)定。MF-08菌株的殼聚糖酶在較低溫度條件下穩(wěn)定性較高，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

2.3.3 殼聚糖酶的最適反應(yīng)pH pH會影響酶的構(gòu)象，以及底物和酶分子活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)，影響酶的催化活性。因此酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性是酶應(yīng)用價(jià)值的重要考察指標(biāo)。由圖11中可以看出，該殼聚糖酶的最適反應(yīng)pH為5.2。與趙玉萍等[12]的研究結(jié)果基本相似。MF-08菌株所產(chǎn)殼聚糖酶具有較寬的pH范圍，pH在4.4～5.8范圍內(nèi)相對酶活性仍能保持在0.8 U/mL以上。

圖11 pH對殼聚糖酶活性的影響Fig.11 Effect of pH on chitosanase activity

2.3.4 pH對殼聚糖穩(wěn)定性的影響 從圖12可以看出，殼聚糖酶在pH4.0～6.0之間活力相對穩(wěn)定，在此區(qū)間范圍內(nèi)，4℃下放置6 h后，殼聚糖酶的剩余酶活力仍能保持在原來的25%～30%。

2.3.5 金屬離子對殼聚糖酶活性的影響 由圖13可以看出，Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋和Na＋對殼聚糖酶活力的影響都不是很明顯。Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋則會對殼聚糖酶活性具有很明顯的抑制作用，尤其是Hg2＋。這和楊立紅[13]和Anh Dzung Nguyen[14]的研究結(jié)果基本一致。原因在于殼聚糖與重金屬離子的螯合作用，從而干擾殼聚糖酶對底物的降解，導(dǎo)致酶活性降低。

圖12 pH對殼聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of pH on the stability of chitosanase

圖13 屬離子對殼聚糖酶活性的影響Fig.13 Effect of metal ions on chitosanase activity

3 結(jié)論

3.1 從實(shí)驗(yàn)室保存的20支產(chǎn)殼聚糖酶的菌種中分離純化出一株產(chǎn)殼聚糖酶活力較高并能穩(wěn)定遺傳的海洋真菌MF-08作為出發(fā)菌株。

3.2 對菌株MF-08進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和26S rDNA序列比對分析，確定海洋真菌MF-08為黃曲霉群（Aspergillus flavus）。

3.3 海洋真菌MF-08部分酶學(xué)性質(zhì)的研究表明：殼聚糖酶的最適作用溫度和最適反應(yīng)pH分別為40℃和pH5.2，酶活在pH4.0～6.0和小于40℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定；Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋和Na＋對殼聚糖酶活力的影響都不是很明顯，Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋則會對殼聚糖酶活性具有很明顯的抑制作用，尤其是Hg2＋。

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Isolation，identification and enzyme characteristics of the chitosanase producing marine fungal MF-08

LI Jia-yin，WANG Hui-min，ZU Guo-ren*
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Isolated and purified a high enzyme activity strain from the chitosanase producing Marine fungi which preservation in laboratory，it was named MF-08.Based on the 26S rDNA sequence analysis and morphological properties，Marine fungi MF-08 was assessed to be Aspergillus flavus.The optimum temperature of chitosanase was 40℃，the optimum pH was 5.2，the chitosanase was stable below 40℃ and pH4.0～6.0，respectively.The enzyme activity was inhibited by Cu2+，F(xiàn)e3+and Hg2+.

marine fungal；chitosanase；26S rDNA

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.032

2015－03－09

李佳茵（1990-），女，碩士研究生，研究方向：微生物生物活性物質(zhì)，E-mail：m15140402799@163.com。

*通訊作者：祖國仁（1963-），男，教授，研究方向：微生物生物活性物質(zhì)，E-mail：rgz321@163.com。