HPLC法測(cè)定刺五加糖漿中五味子醇甲的含量

康宏玲，王志強(qiáng)

(1.沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122;2.撫順市消防支隊(duì)清原縣消防大隊(duì)，遼寧撫順 113300)

刺五加糖漿為益氣健脾、補(bǔ)腎安神的方劑，主要用于脾腎陽(yáng)虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸軟、失眠多夢(mèng)，其主要成分為刺五加浸膏、五味子浸膏［1］，原標(biāo)準(zhǔn)只是對(duì)刺五加苷含量進(jìn)行測(cè)定，并沒(méi)有測(cè)定其中五味子相關(guān)成分的報(bào)道，方劑五味子中的木脂素類化合物為其有效成分，具有益氣生津、收斂固澀、補(bǔ)腎寧心的功效［2］，其中五味子中木脂素類化合物以五味子醇甲的含量居高［3］。筆者采用RP－HPLC法測(cè)定刺五加糖漿中五味子醇甲的含量，以便對(duì)其方劑的品質(zhì)進(jìn)行更好的了解和監(jiān)督，為刺五加糖漿的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent HP1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器);ES－120型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司);超純水發(fā)生系統(tǒng)(MILLIPORE公司);DHG－9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);TurboVapLV氮?dú)獯蹈蓛x(Zymark公司);CX－300W超聲波清洗機(jī)(北京市醫(yī)療設(shè)備二廠);LG10－2.4A型高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);一次性使用無(wú)菌注射器(上海凱樂(lè)輸液器廠);Ф13 mm 0.22 μm一次性微孔樣品過(guò)濾膜(希波氏)。

1.2 試藥 刺五加糖漿(哈爾濱東方制藥有限公司);乙腈，色譜純(Fisher Chemicals公司);甲醇，色譜純(Fisher Chemicals公司)，五味子醇甲為化學(xué)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);無(wú)水乙醇，分析純(安徽安特生物化學(xué)有限公司);乙酸乙酯，分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 000 μg/ml:準(zhǔn)確稱取五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，加入乙腈溶解轉(zhuǎn)移于10 ml容量瓶中定容至刻度，混勻，制備成1 000 μg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備。取刺五加糖漿10 ml于比色管中，加水10 ml，用10 ml乙醇溶液萃取5次，合并每次乙醇萃取液，揮干乙醇液，將殘?jiān)靡译娑ㄈ萦?5 ml容量瓶中，混勻，取適量溶液進(jìn)行高速離心分離后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾上層清液后待測(cè)。

1.3.3 色譜條件。色譜柱為Diamonsil(鉆石)C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，流動(dòng)相為乙腈和水，流動(dòng)相配比為乙腈∶水=50∶50(V/V);DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm;流速為0.8 ml/min;進(jìn)樣量為10 μl;柱溫為25℃。

1.3.4 方法學(xué)考察。

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 ml于10 ml容量瓶中，加入乙腈溶解定容混勻，分別取10 μl注入高效液相色譜儀中進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 精密度試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00 μg/ml)按照“1.3.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。

1.3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取供試品溶液在0、4、10、14、18、22、24 h分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD值。

1.3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一供試品樣品8份，按照“1.3.2”方法制備溶液進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD。

1.3.4.5 回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率試驗(yàn)。取已知含量的供試品樣品6份(五味子醇甲的含量為40.12 μg/ml)，每份準(zhǔn)確量取 10.00 ml，加入200 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 ml，按照“1.3.2”方法制備樣品溶液，制成加樣供試品，取加樣供試品10 μl，注入高效液相色譜儀中進(jìn)樣分析，測(cè)定五味子醇甲的加標(biāo)回收率并計(jì)算RSD值。

1.3.5 樣品含量測(cè)定。取5批供試品樣品，按照“1.3.2”方法處理樣品，在“1.3.3”色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中五味子醇甲的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到五味子醇甲的線性回歸方程為Y=68.654X－5.127，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，由此可以看出五味子醇甲的線性關(guān)系良好，可以滿足日常分析的要求。

2.1.2 精密度試驗(yàn)。在相同條件下對(duì)對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果五味子醇甲峰面積的RSD值為0.8%，表明該儀器的精密度良好，測(cè)定結(jié)果可靠。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。經(jīng)測(cè)定不同時(shí)間的供試品溶液，結(jié)果五味子醇甲峰面積的RSD值為1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)可以穩(wěn)定存在。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取同批次樣品8份，在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得出五味子醇甲峰面積的RSD值為0.9%，可見(jiàn)該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 回收率試驗(yàn)。從五味子醇甲加標(biāo)回收率的結(jié)果(表1)可知，其平均加標(biāo)回收率為96.32%，RSD值為2.3%，表明該方法精密度和準(zhǔn)確度高，可滿足分析檢測(cè)的要求。

表1 五味子醇甲的加標(biāo)回收率

2.2 樣品含量測(cè)定 在確定的最佳試驗(yàn)條件下，5批次供試品中五味子醇甲含量的測(cè)定結(jié)果分別為40.12、42.06、41.29、39.84、42.81 μg/ml(n=3)。

3 討論

3.1 流動(dòng)相組成的確定 在高效液相色譜分析中，流動(dòng)相的恰當(dāng)選擇對(duì)改善分離效果起到重要的作用。從實(shí)用角度考慮，流動(dòng)相的溶劑應(yīng)當(dāng)使用安全、容易購(gòu)得、純度高。除此之外，流動(dòng)相溶劑應(yīng)使色譜柱的柱效不受影響，保持色譜柱的穩(wěn)定。該試驗(yàn)考察了甲醇－水和乙腈－水2種流動(dòng)相體系對(duì)樣品分離情況的影響，結(jié)果表明在相同配比的2種流動(dòng)相體系中應(yīng)用乙腈－水為流動(dòng)相會(huì)使分析時(shí)間大大減少，并能有效地改善峰形，使峰形變窄，對(duì)稱性好，且分離度和洗脫的效果更好，減小了包峰和拖尾的現(xiàn)象，所以該試驗(yàn)采用乙腈－水為流動(dòng)相。

3.2 流動(dòng)相配比的確定 試驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相配比對(duì)樣品分離的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相配比中乙腈的比例過(guò)小，會(huì)增加分析時(shí)間，使色譜峰變寬，但乙腈的比例過(guò)大，使樣品中五味子醇甲與周圍干擾物質(zhì)無(wú)法分離，出現(xiàn)嚴(yán)重的包峰現(xiàn)象，綜合考慮分離度、時(shí)間和峰形等因素，試驗(yàn)選擇乙腈∶水=50∶50的流動(dòng)相配比。從圖1可看出，在13.7 min時(shí)均出現(xiàn)五味子醇甲的色譜峰，且樣品中五味子醇甲與周圍干擾峰分離良好。

3.3 流速的確定 流動(dòng)相的流速會(huì)對(duì)色譜柱的保留時(shí)間、柱效能及柱壓產(chǎn)生影響。該試驗(yàn)分別考察了0.6、0.8、1.0、1.2 ml/min 4種流速下對(duì)保留時(shí)間、柱效能及柱壓的影響，結(jié)果表明流速增大，五味子醇甲的保留時(shí)間縮短，但柱壓升高;流速太小，柱壓減小，但色譜峰加寬，分析速度慢，當(dāng)流速為0.8 ml/min時(shí)，理論塔板數(shù)最大，柱效能最好，為此試驗(yàn)選擇0.8 ml/min為最佳流速。

3.4 進(jìn)樣量的確定 在高效液相色譜中，進(jìn)樣量是影響檢測(cè)器靈敏度的重要因素之一。此外，進(jìn)樣量的大小還會(huì)影響色譜峰的峰形，甚至影響分離度。進(jìn)樣量太小，被測(cè)物質(zhì)不易被檢出，靈敏度低;進(jìn)樣量太大，易發(fā)生峰變形、拖尾等現(xiàn)象，使色譜峰對(duì)稱性下降。該試驗(yàn)以樣品溶液分別進(jìn)樣5、10、15、20 μl比較不同進(jìn)樣量對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量＞15 μl時(shí)，五味子醇甲的色譜峰變寬，與周圍干擾物質(zhì)達(dá)不到良好的基線分離，為此試驗(yàn)考慮分離度和靈敏度等因素選擇10 μl為最佳進(jìn)樣量。

3.5 柱溫的確定 柱溫是影響分離效能和分析速度的重要參數(shù)，該試驗(yàn)分別考察了柱溫在20、25、30、35℃時(shí)對(duì)樣品中各種物質(zhì)分離度的影響，發(fā)現(xiàn)樣品中五味子醇甲在25℃時(shí)與周圍物質(zhì)的分離度和柱效能最好，當(dāng)溫度＞30℃時(shí)分離度均小于1.0，說(shuō)明分離不好，所以試驗(yàn)選擇25℃為最佳柱溫。

3.6 樣品萃取溶劑的確定 試驗(yàn)中根據(jù)五味子醇甲的理化性質(zhì)和相關(guān)參考文獻(xiàn)，分別試用了甲醇、乙醇、乙酸乙酯作為萃取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇的揮發(fā)速度很快，且檢測(cè)波長(zhǎng)在216 nm時(shí)出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾，乙酸乙酯作為萃取溶劑，萃取效果不佳，使測(cè)定結(jié)果明顯偏低，為此該試驗(yàn)選擇乙醇為萃取溶劑。

［1］張旭東，王蕊，張淑慧.復(fù)方刺五加糖漿的制備［J］.河北醫(yī)藥，2008，30(9):1418－1419.

［2］靳杰.中藥五味子的研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2005，18(5):335.

［3］付紹平，張峰，張慧，等.反相高效液相色譜法測(cè)定五味子中木脂素的含量［J］. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2004，18(S1):32－34.