一種檢測(cè)食品中細(xì)菌總數(shù)的顯色紙片的制作方法

胡元森，王玉利，呂揚(yáng)勇，雷 陽，陳 靜，李翠香

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 前言

由細(xì)菌引起的食源性傳染病及食物中毒事件占整個(gè)食品安全事件的80%以上[1-2]，食品中細(xì)菌數(shù)量及種類是評(píng)價(jià)食品安全性的重要指標(biāo)之一[3-4].近些年，國(guó)內(nèi)外發(fā)展了一些食品中的微生物檢測(cè)方法，如測(cè)試片技術(shù)[5]、生物電化學(xué)技術(shù)[6]、免疫學(xué)方法[7]、生物發(fā)光技術(shù)[8]等，這些方法技術(shù)先進(jìn)，但檢測(cè)需要精密儀器，檢測(cè)成本高，難以在生產(chǎn)中推廣.現(xiàn)有食品菌落總數(shù)檢測(cè)采用的國(guó)標(biāo)方法程序煩瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，在多個(gè)環(huán)節(jié)容易影響檢測(cè)結(jié)果[9-10].因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)的細(xì)菌檢測(cè)方法十分重要.

快速檢測(cè)試紙片是一種預(yù)先制備好的一次性培養(yǎng)基制品，含有微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)及脫氫酶指示劑，能使菌體在測(cè)試片上呈紅色而增強(qiáng)計(jì)數(shù)效果[11].目前，國(guó)內(nèi)外已有類似的產(chǎn)品，應(yīng)用最多的檢測(cè)試紙片為3M 公司生產(chǎn)的petrifilm 系列檢測(cè)紙片，但該產(chǎn)品價(jià)格較高，在國(guó)內(nèi)不能得到廣泛應(yīng)用.國(guó)內(nèi)也出現(xiàn)了多種快速檢測(cè)紙片，但產(chǎn)品均有需改進(jìn)之處，如涂布不勻、吸水性和保濕性差、菌體顯色不完全等[12-13].

作者從載體和培養(yǎng)基、固著劑及顯色劑TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）濃度、片基烘干溫度及時(shí)間等方面對(duì)顯色紙片的制作進(jìn)行了研究，建立了一種可用于檢測(cè)食品中細(xì)菌總數(shù)的顯色紙片的制作方法.本顯色紙片制作和使用簡(jiǎn)單、顯色快速、價(jià)格低廉，可在一般實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，具有良好的發(fā)展前景.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株

大腸埃希氏菌（Escherich coli）為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，無致病性.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L.

1.1.3 主要化學(xué)試劑

TTC：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖、明膠等均為國(guó)產(chǎn)，分析純.

1.2 方法

1.2.1 顯色紙片制作流程

顯色紙片的一般制作流程為：選取顯色紙片片基→確定最佳營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)→確定營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的固著劑→確定最佳顯色物質(zhì)濃度→將含最佳固著劑、顯色物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)基涂布于顯色紙片片基上→確定最佳干燥條件→效果檢測(cè).

1.2.2 顯色紙片片基的選擇

顯色紙片片基需具有良好的吸水性、熱穩(wěn)定性、孔隙均勻等特點(diǎn).選取硝酸纖維素膜、純木棉紙和定性濾紙作為顯色紙片的片基，將1 mL 的大腸桿菌菌懸液滴在直徑為9 cm 的上述3 種片基上，涂布均勻，觀察3 種片基的吸水速度.然后將該片基置于80 ℃烘箱干燥30 min，觀察其變形情況.

1.2.3 顯色紙片培養(yǎng)基固著劑的選擇

分別制備含8%明膠、1.5%瓊脂糖和1%硅膠的LB 半固體培養(yǎng)基，將片基在各培養(yǎng)基中浸泡5 min 后取出，于80 ℃烘箱干燥，然后滴加1 mL 大腸桿菌懸液，于37 ℃培養(yǎng).觀察3 種固著劑紙片的吸水情況及菌體培養(yǎng)后的顯色情況.

1.2.4 明膠濃度的確定

明膠濃度會(huì)影響顯色紙片的吸水性、保濕性及菌落形成速度，進(jìn)而影響樣品檢測(cè)效果.分別考察培養(yǎng)基中添加6%、8%、10%、12%、14%和17%的明膠對(duì)顯色紙片制作及大腸桿菌生長(zhǎng)的影響.

1.2.5 TTC 濃度的確定

培養(yǎng)基中TTC 濃度高低會(huì)影響細(xì)菌菌落顏色深淺和菌落生長(zhǎng)速度.試驗(yàn)分別考察了向培養(yǎng)基添加0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的TTC 時(shí)顯色紙片對(duì)大腸桿菌的培養(yǎng)顯色效果.

1.2.6 顯色紙片烘干溫度和時(shí)間的確定

按前述已確定的最佳培養(yǎng)基、固著劑濃度、TTC 添加量等，制備顯色紙片.然后將片基在85 ℃下干燥，干燥時(shí)間為10、20、25、30 和35 min，然后考察該顯色紙片對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)效果，確定最佳烘干溫度和時(shí)間.

1.2.7 顯色紙片的穩(wěn)定性

制備顯色紙片后，分別在室溫光照處、45 ℃培養(yǎng)箱、25 ℃黑暗避光處放置4 d 和30 d，以及在40 W 紫外燈下20 cm 處放置4 h 時(shí).取出后，在其上滴加大腸桿菌菌懸液，37 ℃培養(yǎng)，觀察大腸桿菌的培養(yǎng)效果.

1.2.8 顯色紙片與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)細(xì)菌的效果比較

將已培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液進(jìn)行梯度稀釋制備菌懸液.同時(shí)取鮮肉25 g，切碎，勻漿，制成合適濃度的樣品懸液.分別用顯色紙片及國(guó)標(biāo)法對(duì)大腸桿菌稀釋液及鮮肉樣品稀釋液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，比較兩者計(jì)數(shù)結(jié)果的差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色紙片片基的選擇

研究了硝酸纖維素膜、木棉紙和定性濾紙為片基制作顯色紙片的效果，結(jié)果見圖1.由圖1 可見，在加入大腸桿菌菌懸液時(shí)，菌懸液在木棉紙片和定性濾紙上能夠均勻地?cái)U(kuò)散并在1 min 內(nèi)被完全吸收.硝酸纖維素膜吸水能力較差，菌懸液在其表面積存.將3 種片基進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硝酸纖維素膜顏色變黃，定性濾紙發(fā)生皺折現(xiàn)象，而木棉紙穩(wěn)定性較好，沒有明顯的皺縮現(xiàn)象.因此，選取木綿紙為顯色紙片的片基.

圖1 顯色紙片片基的吸水性與熱穩(wěn)定性Fig.1 Water absorption and heat stability of colordeveloping test paper

2.2 顯色紙片培養(yǎng)基固著劑的確定

培養(yǎng)基固著劑可將營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)固著在紙片片基上，同時(shí)保持菌體生長(zhǎng)所需充足水分.試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，硅膠吸水能力較強(qiáng)，但溶解性差，不能使培養(yǎng)基黏附于片基上.瓊脂糖可增加培養(yǎng)基黏著力，但制作的紙片培養(yǎng)基吸水效果差.添加明膠的片基干燥后與培養(yǎng)皿緊貼，不發(fā)生形變，且能在1～2 min 使1 mL 的菌液完全吸收.圖2 顯示，添加瓊脂糖的紙片培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落彌散，有拖尾現(xiàn)象，計(jì)數(shù)困難，在添加有明膠的培養(yǎng)基紙片上菌落形成較好，菌落分布相對(duì)均勻.

圖2 試紙片上固著劑的選擇Fig.2 Fixing agent selection of test paper

2.3 顯色紙片中明膠濃度的確定

圖3 顯示，培養(yǎng)基中添加6%～17%的明膠對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)均無明顯影響.但當(dāng)明膠濃度過高時(shí)，其對(duì)滴加于紙片上的水分吸附力增強(qiáng)，培養(yǎng)后菌落生長(zhǎng)過于集中，菌落小，不易觀察；當(dāng)明膠濃度較低時(shí)，菌懸液擴(kuò)散太快，菌落形成聚集，影響菌落計(jì)數(shù).當(dāng)明膠濃度為12%時(shí)，水分?jǐn)U散速度適中，菌懸液涂布后，能在整個(gè)基面均勻分布，菌液吸收完全，培養(yǎng)后菌落形成較好，容易觀察（圖3-D）.

圖3 培養(yǎng)基中明膠濃度的確定Fig.3 Determination of the concentration of gelation in the medium

2.4 紙片顯色培養(yǎng)基中TTC 濃度的確定

TTC 濃度偏低時(shí)，菌體顯色不完全；濃度過高時(shí)，則抑制菌體生長(zhǎng).以大腸桿菌為測(cè)試菌株，研究了顯色紙片中TTC 濃度對(duì)檢測(cè)效果的影響，結(jié)果見圖4.由圖4 可見，TTC 濃度為0.005%和0.01%時(shí)，菌落顯色較淺，濃度為0.02%時(shí)菌落能夠形成，且紅色較明顯.隨著TTC 濃度增加，菌落生長(zhǎng)及顯色沒有明顯改善.因此，0.02%的TTC 濃度較為適宜.

圖4 培養(yǎng)基中TTC 濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of TTC concentration on the growth of Escherichia coli in the medium

2.5 顯色紙片干燥時(shí)間的確定

紙片顯色制作時(shí)需進(jìn)行干燥處理，將浸泡過培養(yǎng)液的片基放在高溫下干燥，考察干燥時(shí)間對(duì)顯色紙片的影響，結(jié)果見圖5.由圖5 可見，85 ℃處理10 min，紙片培養(yǎng)基即可被烘干，延長(zhǎng)時(shí)間并沒有改善培養(yǎng)效果，用90 ℃以上的高溫處理片基時(shí)容易使之變黃，影響后續(xù)試驗(yàn)觀察.因此，確定紙片干燥溫度為85 ℃，干燥時(shí)間為10 min.

圖5 片基最佳干燥時(shí)間確定Fig.5 Determination of the optimum paper drying time

2.6 利用顯色紙片檢測(cè)細(xì)菌的效果

分別用顯色紙片法與LB 培養(yǎng)基稀釋平板涂布法測(cè)定3 個(gè)稀釋度的大腸桿菌懸液，結(jié)果見圖6.結(jié)果顯示，兩種方法培養(yǎng)獲得的菌落數(shù)目相當(dāng)，差異不明顯.但當(dāng)用顯色紙片培養(yǎng)約16 h，大腸桿菌紅色菌落清晰可見，繼續(xù)培養(yǎng)菌落數(shù)量不再增加.而在LB 培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h 以上才可看到明顯的菌落.這一結(jié)果表明，顯色紙片與LB 培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌的結(jié)果具有一致性，但其檢測(cè)時(shí)間大幅縮短.

圖6 顯色紙片與LB 培養(yǎng)基測(cè)定大腸桿菌菌落數(shù)Fig.6 Determination of the total count of Escherichia coli by test paper and LB medium

用LB 培養(yǎng)基和顯色紙片分別測(cè)定鮮肉中的帶菌量，結(jié)果見圖7.結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)法獲得的細(xì)菌數(shù)量在各稀釋度均較為一致，表明可用本法制備的顯色紙片替代常規(guī)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)中的LB培養(yǎng)基進(jìn)行食品細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定.

圖7 顯色紙片與LB 培養(yǎng)基測(cè)定鮮肉中細(xì)菌總數(shù)Fig.7 Determination of the total count in freshmeat by test paer and LB medium

2.7 顯色紙片穩(wěn)定性研究

考察了顯色紙片在光照、高溫、紫外輻照等條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖8.圖8 顯示，在光照處理后，由于顯色劑TTC 見光分解導(dǎo)致顯色紙片顯紅色，菌體生長(zhǎng)時(shí)菌落顏色顯色不夠（圖8-A），光照時(shí)間越長(zhǎng)，TTC 分解越多，紙片本底紅色愈強(qiáng)（圖8-A，圖8-B）.顯色紙片在常溫和45 ℃高溫避光存放30 d，兩者對(duì)同一樣品檢測(cè)到的細(xì)菌數(shù)量相當(dāng)，45 ℃高溫處理后，顯色紙片上細(xì)菌生長(zhǎng)菌落較小，菌落顏色也不明顯（圖8-C,圖8-D），說明高溫處理對(duì)紙片顯色培養(yǎng)基及顯色劑均有不利影響.同時(shí)發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間紫外光照對(duì)顯色紙片的檢測(cè)效果沒有影響（圖8-E）.這一結(jié)果說明本顯色紙片受溫度影響不大，但應(yīng)避光保存.

圖8 不同條件對(duì)試紙顯色培養(yǎng)基穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different conditins on the stability of color-developing test paper medium

3 結(jié)論

研究了一種可用于檢測(cè)食品中細(xì)菌總數(shù)的顯色紙片的制備方法，該顯色紙片以木棉紙為片基，以12%明膠為營(yíng)養(yǎng)基固著劑，以LB 培養(yǎng)液為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中添加TTC 作為顯色劑，其最佳終濃度為0.02%，在85 ℃烘箱中干燥10 min 即可.本顯色紙片避光保存時(shí)的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性較好.

用本文所制作的顯色紙片與用傳統(tǒng)的稀釋平板涂布進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)的結(jié)果具有一致性.本顯色紙片在培養(yǎng)約16 h 就能看到明顯的紅色菌落，較傳統(tǒng)平板培養(yǎng)肉眼可見菌落縮短了8～12 h.本顯色紙片制作和使用簡(jiǎn)便、顯色明顯、計(jì)數(shù)效果好，便于推廣.

［1］羅雪云，劉宏道.食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

［2］孫京新，李曉峰，于海峰，等.肉品中菌落總數(shù)和大腸菌群快速檢測(cè)試紙片的研究［J］.肉類工業(yè)，2009（7）:23-26.

［3］張遠(yuǎn).我國(guó)食品安全問題分析及其對(duì)策［J］.中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng)，2005（9）:15-18.

［4］陳廣全，袁軍.食品中細(xì)菌快速檢測(cè)方法進(jìn)展［J］.現(xiàn)代商檢科技，1996，6（4）:56-60.

［5］李文勇，刁伯民.國(guó)標(biāo)法和紙片法對(duì)餐具大腸菌群檢測(cè)比較［J］.中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，1994，17（6）:360-361.

［6］盧智遠(yuǎn)，牛中奇，劉啟，等.一種微生物檢測(cè)的生物電化學(xué)方法研究［J］.傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，18（3）:481-483.

［7］陳愛華，楊堅(jiān).酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)食品添加劑，2004，4:109-111.

［8］Cho Min，Yoon Jeyong.The application of bioluminescence assay with culturing for evaluating quantitative disinfection performance［J］.Water Research，2007，41（4）:741-746.

［9］周建新.食品中菌落總數(shù)和大腸菌群檢驗(yàn)的質(zhì)量控制［J］.糧食與食品工業(yè)，2007，14（3）:42-45.

［10］孫京新，仇宏偉，李鳳梅，等.食品中硝酸鹽快速檢測(cè)試紙條的設(shè)計(jì)與應(yīng)用［J］.食品科技，2008（7）:224-226.

［11］陳春田，李金有，王林，等.細(xì)菌快速檢測(cè)試紙片法與傳統(tǒng)方法培養(yǎng)結(jié)果的比較［J］.中國(guó)消毒學(xué)雜志，2010，27（5）:547-548.

［12］紀(jì)淑娟，浩淼，李東華.TTC 法檢測(cè)牛乳中抗生素快速檢測(cè)試紙的制作［J］.食品工業(yè)科技，2009（3）:322-327.

［13］段友容，萬昌秀，吳剛，等.干片法在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，1999，20（1）:40-42.