檸檬汁輔助雪梨汁催化轉(zhuǎn)化原人參二醇組皂苷制備稀有人參皂苷Rg3

成樂(lè)琴，金富標(biāo)

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

0 前言

人參皂苷是人參的有效活性成分，人參皂苷Rg3 作為次級(jí)人參皂苷，對(duì)肺癌、胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞均具有一定的抑制作用[1]，此外，人參皂苷Rg3還具有抗衰老、降壓、增強(qiáng)身體免疫力等作用[2].目前，人參皂苷Rg3 的制備方法主要有酸水解法[3]、酶和微生物降解法[4]、半合成法[5]等，其中采用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸試劑水解最為常見(jiàn).自然界中有很多富含有機(jī)酸的天然物，例如具有清肺止咳功效的雪梨[6]主要含有蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸以及少量乙酸、琥珀酸等.在前期研究檸檬[7-8]和葡萄[9]催化制備人參皂苷Rg3 的基礎(chǔ)上，作者利用來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、可以食用的雪梨為酸催化劑，以原人參二醇組皂苷為原料，在檸檬汁輔助下制備稀有人參皂苷Rg3，探索安全、綠色環(huán)保的制備人參皂苷Rg3 的方法，也為含有清肺止咳功效的雪梨成分的人參皂苷Rg3 產(chǎn)品應(yīng)用于保健食品提供技術(shù)支持和產(chǎn)品支持.

1 原料與方法

1.1 原料和試劑

雪梨、檸檬由超市購(gòu)買(mǎi)；人參根總皂苷：吉林撫松第一參廠；甲醇、正丁醇、氯仿、硫酸為分析純；HPLC 檢測(cè)中所用的甲醇、乙腈為色譜純；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室去離子水；人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3 標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼斯特生物科技有限公司.

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：大連依利特分析儀器有限公司；色譜柱Pinnacle ⅡC18：RESTEK U.S 的250 mm×4.6 mm，5 μm；RE-52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人參根總皂苷中原人參二醇組皂苷的分離提純

按文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行原人參二醇組皂苷（以下簡(jiǎn)稱PPD 皂苷）的分離.

1.3.2 檸檬汁輔助雪梨汁制備人參皂苷Rg3 的方法

取若干2.0 mL 離心管，加入200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的PPD 水溶液，加入一定量的不同配比的檸檬汁和雪梨汁的混合液，在一定溫度下反應(yīng)數(shù)小時(shí).反應(yīng)產(chǎn)物加入碳酸鈉水溶液調(diào)節(jié)pH=7，用等體積水飽和正丁醇反復(fù)萃取5 次，合并有機(jī)層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干.殘留物中加入2 mL 色譜純甲醇，超聲加速溶解，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，并通過(guò)HPLC 進(jìn)行人參皂苷的定量分析.人參皂苷Rg3 的收率以其兩種差向異構(gòu)體20（S）-Rg3 和20（R）-Rg3 的收率之和計(jì)算，具體計(jì)算公式如下：

式中，人參皂苷Rg3 的理論產(chǎn)量是原料PPD 皂苷中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 等5 種皂苷100%轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rg3 時(shí)的兩種差向異構(gòu)體20（S）-Rg3 和20（R）-Rg3 的理論產(chǎn)量之和.

1.3.3 HPLC 分析方法

流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相A 為乙腈，B 為純凈水（超聲除氣處理）.梯度洗脫程序：0.00～10.00 min，A:22% ；10.00～20.00 min，A:22% ；20.00～25.00 min，A:27% ；25.00～45.00 min，A:31% ；45.00～60.00 min，A:38% ；60.00～65.00 min，A:52% ；65～75 min，A:52% ；75.00～75.10 min，A:55%；75.10～95.00 min，A:90%；95.00～95.10 min，A:90%；95.10～104.00 min，A:22%.

2 結(jié)果與討論

2.1 原料中PPD 皂苷的分離及含量的測(cè)定

以人參根總皂苷為原料（其中原人參二醇組皂苷的含量為61.32%），按照文獻(xiàn)[10]的方法，利用D101C 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解析，并結(jié)合溶劑沉淀法分離了PPD 皂苷.PPD 皂苷的HPLC 分析圖見(jiàn)圖1.

圖1 分離提純后PPD 皂苷的HPLC 分析圖Fig.1 HPLC analysis of PPD saponins after separation and purification

對(duì)圖1 中在保留時(shí)間37.85 min、39.43 min、41.70 min、42.39 min 和46.13 min 出現(xiàn)的PPD 皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 的吸收峰分別進(jìn)行了定量（相應(yīng)對(duì)照品的保留時(shí)間參見(jiàn)圖2-A），結(jié)果表明5 種皂苷的總含量為92.78%，即純度比分離提純之前提高了51.3%.具體皂苷含量數(shù)據(jù)見(jiàn)表1.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 檸檬汁與雪梨汁的配比對(duì)人參皂苷Rg3 收率的影響

在裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液的2.0 mL 離心管中，分別加入200 μL雪梨汁和檸檬汁配比為100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40 的混合液，在90 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 分析結(jié)果見(jiàn)表2.

表1 PPD皂苷中具體皂苷的定量分析結(jié)果Table 1 Quantitative analysis of specific ginsenoside in PPD saponins

由表2 可知，用100%雪梨汁催化反應(yīng)時(shí)，人參皂苷Rg3 的收率較低，但加入少量檸檬汁時(shí)，Rg3 的收率顯著提高，但繼續(xù)加大檸檬汁比例，雖然PPD 皂苷中各種皂苷的轉(zhuǎn)化率還在提高，但Rg3 的收率卻反而下降，這是因?yàn)楫?dāng)檸檬酸比例過(guò)大時(shí)，溶液酸性過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致Rg3 進(jìn)一步水解成Rg5等其他次級(jí)人參皂苷.考慮到檸檬汁主要是輔助雪梨汁，且其市場(chǎng)價(jià)格較高，因此選擇雪梨汁與檸檬汁的配比為90∶10 進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化.

表2 不同雪梨汁與檸檬汁配時(shí)人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 2 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different snow pear juice and lemon juice ratio

2.2.2 PPD 皂苷與水果汁體積比對(duì)人參皂苷Rg3收率的影響

在裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液的2.0 mL 離心管中，按照1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6 體積比分別加入配比為90∶10 的雪梨汁和檸檬汁的混合液160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL，并在90 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 分析結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 不同PPD 皂苷與水果汁體積比時(shí)人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 3 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different PPD saponins and fruit juice volume ratio

由表3 可見(jiàn)，隨著果汁用量的增加，人參皂苷Rg3 的收率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)PPD 與果汁體積比為1∶1.4 時(shí)，人參皂苷Rg3 的收率達(dá)到68.97%，而進(jìn)一步增加體積比，Rg3 的收率和得率明顯下降，說(shuō)明PPD 與混合果汁體積比為1∶1.4時(shí)，反應(yīng)效果最佳.

2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)人參皂苷Rg3 的收率影響

將裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液與配比為90∶10 的雪梨汁與檸檬汁溶液以1∶1.4 混合均勻，分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 不同反應(yīng)溫度下人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 4 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different reaction temperature

由表4 可見(jiàn)，隨著反應(yīng)溫度從75 ℃到90 ℃不斷升高，PPD 皂苷的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg3 的收率均在逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，雖然PPD 皂苷的轉(zhuǎn)化率仍在增加，但人參皂苷Rg3 的收率卻沒(méi)有增加，說(shuō)明較高的反應(yīng)溫度會(huì)導(dǎo)致其他副反應(yīng)的發(fā)生.由此可見(jiàn)，制備人參皂苷Rg3 的適宜反應(yīng)溫度為90 ℃.

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)制備人參皂苷Rg3 收率的影響

將裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液與配比為90∶10 雪梨汁與檸檬汁溶液以1∶1.4 混合均勻，在90 ℃水浴鍋中分別反應(yīng)3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 分析結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 不同反應(yīng)時(shí)間人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 5 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different reaction time

由表5 可見(jiàn)，在3.0～4.5 h 范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除了Rb3 的轉(zhuǎn)化率有所波動(dòng)以外，其他PPD 皂苷的轉(zhuǎn)化率及Rg3 的收率均顯著增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4.5 h 時(shí)，人參皂苷Rg3 的收率達(dá)到最高為76.00%（見(jiàn)圖2），而繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，Rg3 的收率反而下降.這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPD 皂苷原料逐漸枯竭，使PPD 皂苷轉(zhuǎn)化生成Rg3 的速率低于生成的Rg3 進(jìn)一步通過(guò)脫水生成Rg5、Rk1、Rz1 及通過(guò)水解生成其他副產(chǎn)品的速率.

圖2 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(A)及反應(yīng)時(shí)間為4.5 h 時(shí)PPD 皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(B)的HPLC 分析譜圖Fig.2 HPLC analysis of ginsenoside standards(A) and transformation product(B) for PPD saponins in 4.5 h reaction time

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了檸檬汁輔助雪梨汁催化水解PPD 皂苷制備稀有人參皂苷Rg3 的工藝條件.結(jié)果表明，人參皂苷Rg3 的最高收率為76.00%，與單獨(dú)使用檸檬汁的收率相當(dāng)[8]，說(shuō)明混合果汁具有很強(qiáng)的酸催化效果及制備人參皂苷Rg3 的能力；同時(shí)通過(guò)檸檬汁輔助雪梨汁制備人參皂苷Rg3 時(shí)，檸檬汁的用量不足單獨(dú)使用檸檬汁時(shí)其用量的1/6，不僅酸性更加溫和，更容易控制反應(yīng)，而且還能降低成本.

利用富含果酸的雪梨汁與檸檬汁混合液處理PPD 皂苷制備人參皂苷Rg3，與酸性化學(xué)試劑作酸催化劑相比，反應(yīng)過(guò)程綠色無(wú)污染、操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)產(chǎn)物兼具人參成分和水果成分，可有效改善產(chǎn)品口感，為大量天然糖苷類化合物的水解制備藥效更好的次級(jí)苷提供了新的途徑.

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