雞胰臟中胰酶提取工藝技術(shù)研究

周雅丹，張國(guó)治，范 璐

（河南工業(yè)大學(xué)1.糧油食品學(xué)院；2.分析測(cè)試中心，河南 鄭州 450001）

0 引言

胰酶是從動(dòng)物胰臟中提取的一種混合酶制劑，含有胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶3 種主要消化酶和其他生物活性物質(zhì).胰酶在食品工業(yè)、皮革工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)，以及科研等領(lǐng)域都有廣泛的用途.在食品加工業(yè)中應(yīng)用胰酶生產(chǎn)氨基酸以及干酪素等；皮革工業(yè)中應(yīng)用胰酶脫脂、軟化，不僅能提高產(chǎn)品質(zhì)量和等級(jí)，而且可以節(jié)約成本；在醫(yī)藥上可以作為助消化藥物，用于治療消化不良，食欲不振，慢性胰腺炎等疾??；在科研領(lǐng)域，胰酶主要應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究等[1-5].生產(chǎn)胰酶的方法有堿溶液提取法、酸溶液提取法、鹽溶液提取法、水洗提取法、有機(jī)溶劑提取法和超聲波輔助堿提法等，目前國(guó)內(nèi)從豬胰臟中提取胰酶的報(bào)道有很多[6-8]，且大都使用有機(jī)溶劑提取方法.作者以雞胰臟為原料，采用有機(jī)溶劑提取法，通過單因素試驗(yàn)研究提取胰酶條件的pH、溫度、時(shí)間，以及提取溶劑異丙醇濃度對(duì)胰酶活力及相關(guān)品質(zhì)的影響，并通過正交試驗(yàn)確定雞胰酶制備最佳工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胰臟購(gòu)于鄭州菜市場(chǎng)；氯化鈣、三氯醋酸、阿拉伯膠粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖、馬鈴薯淀粉、牛膽鹽：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、硫代硫酸鈉：北京化工廠；硼酸：北京朝陽區(qū)金盞化工廠；異丙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；丙酮：洛陽市化學(xué)試劑廠.所有試劑均為分析純.

1.2 主要儀器與設(shè)備

pHB-5 便攜式pH 計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；UV-2600 紫外分光光度計(jì)、AY-120 電子分析天平：日本島津；J-26XP 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫爾特；HHS 型電熱恒溫水浴鍋：金壇市華峰儀器有限公司；LGJ-18C 冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；冰箱：青島海爾股份有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

新鮮/冷凍雞胰臟→胰漿→激活提取→過濾→胰乳濾液→高濃度異丙醇沉淀→離心→脫脂→冷凍真空干燥→胰酶粉.

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力、脂肪殘留和干燥失重為胰酶鑒定指標(biāo)，在工業(yè)化生產(chǎn)中胰酶提取率也是重要考察指標(biāo).在制備過程中，沉淀劑異丙醇濃度60%、沉淀溫度4 ℃、脫脂劑為預(yù)冷丙酮不變，通過改變提取激活條件的pH、溫度、提取劑濃度和時(shí)間，分別做3 次重復(fù)試驗(yàn)，考察這些因素對(duì)雞胰酶活力、提取率和其他品質(zhì)指標(biāo)的影響.

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在提取激活pH、溫度、提取劑濃度和時(shí)間4 個(gè)因素中，每個(gè)因素選擇三水平，選用正交表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，從中選出最佳水平組合.

1.3.4 胰酶活力測(cè)定及相關(guān)品質(zhì)測(cè)定的方法

胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活力及相關(guān)品質(zhì)（脂肪殘留、干燥失重）的測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)藥典》[9].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取激活pH 值對(duì)胰酶活力的影響

考察提取激活pH 為4、5、6、7、8 對(duì)胰酶活性的影響，其他工藝參數(shù)為：提取劑濃度為10%、激活時(shí)間為6 h、提取激活溫度為5 ℃、保護(hù)劑為麥芽糖0.5%，馬鈴薯淀粉0.5%、激活劑為氯化鈣0.2%、沉淀劑濃度為60%，在不同pH 條件下制備胰酶，試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，胰酶活力及其他品質(zhì)指標(biāo)結(jié)果見表1，pH 為6 時(shí)，三酶活力及提取率均最高，因此單從pH 來考慮，pH 在5～7 之間，酶活力較高.

表1 不同提取激活pH值對(duì)胰酶的三酶活力、提取率及其他品質(zhì)的影響Table 1 Effects of different pH value of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.1.2 提取激活溫度對(duì)胰酶活力的影響

其他提取條件不變，提取激活溫度設(shè)定為5℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃，試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，胰酶活力及其他指標(biāo)結(jié)果見表2.溫度過高，導(dǎo)致胰酶失活，當(dāng)溫度高于或低于15 ℃，三酶活力及質(zhì)量收率都降低，溫度在（15±5）℃范圍內(nèi)，胰酶活力和提取率較高.

表2 不同提取激活溫度對(duì)胰酶的三酶活力、提取率及其他品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different temperature of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.1.3 提取劑濃度對(duì)胰酶活力的影響

其他提取條件不變，提取劑濃度設(shè)為5%、10%、15%、20%、25%，試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，胰酶活力及其他指標(biāo)結(jié)果見表3.隨著異丙醇濃度增加，三酶活力均是先增加后降低，要保證較高的酶活力和提取率，同時(shí)節(jié)省異丙醇用量，激活提取過程中應(yīng)選擇提取劑濃度在5%～10%之間.

表3 不同提取劑濃度對(duì)胰酶的三酶活力、提取率及其他品質(zhì)的影響Table 3 Effects of isopropyl alcohol concentration of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.1.4 提取激活時(shí)間對(duì)胰酶活力的影響

考察激活提取時(shí)間為2、4、6、8、10 h 對(duì)提取效果的影響，試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，結(jié)果見表4.提取激活時(shí)間為6 h 時(shí)，三酶活力達(dá)到最高.時(shí)間過短，胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶未被完全溶出，活力較低；時(shí)間過長(zhǎng)，酶自身降解，酶活力降低.隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，三酶活力均是先增加后降低，要保證較高的酶活力和提取率，激活提取時(shí)間選擇在5～7 h 之間.

表4 不同提取激活時(shí)間對(duì)胰酶的三酶活力、提取率及其他品質(zhì)的影響Table 4 Effects of different time of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析（表5—表8）

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定激活提取pH 5～7，溫度（15±5）℃，提取劑濃度5%～10%，時(shí)間5～7 h，通過L9（34）正交試驗(yàn)確定提取雞胰酶最佳工藝參數(shù).從表7 可確定最優(yōu)組合為A3B1C2D1，由表8可知，胰酶制備在該工藝條件下是可行的，胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)（胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力分別為4 000 U/g、7 000 U/g、600 U/g，脂肪殘留量為20 mg·g-1，干燥失重5%）.

表5 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Table 5 The factors levels of orthogonal test L9（34）

表6 正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果Table 6 The results of the orthogonal test L9（34）

表7 正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果Table 7 The visual analysis results of the orthogonal test L9（34）

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)所得到胰酶的三酶活力、提取率和其他指標(biāo)Table 8 The three enzyme activity,yield and other indicators of pancreatin of verification experiments

3 結(jié)論

通過對(duì)雞胰臟中提取胰酶的工藝條件的探討，確定最佳優(yōu)化工藝條件為：以新鮮或冷凍雞胰臟為原料，使用濃度為7.5%異丙醇為提取劑（原料量的1.5 倍），同時(shí)加入激活劑（氯化鈣0.2%），保護(hù)劑（麥芽糖0.5%，馬鈴薯淀粉0.5%），在溫度為(10±1) ℃，pH 為7 條件下提取激活5 h 后過濾，將預(yù)冷至4 ℃99.7%的異丙醇加入濾液中，使異丙醇濃度達(dá)到60%，冷凍離心沉淀，用預(yù)冷丙酮進(jìn)行脫脂，冷凍真空干燥，粉碎得到胰酶粉.在該工藝條件下制備的胰酶中胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力分別為13 830 U/g、11 600 U/g、1 596 U/g，提取率為9.2%，脂肪殘留量為18.99 mg·g-1，干燥失重3.86%，均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)（胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力、脂肪殘留量、干燥失重分別為4 000 U/g、7 000 U/g、600 U/g、20 mg·g-1、5%）.

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