依達(dá)拉奉對(duì)過氧化氫致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

陳 麗，李萬奎

近年來，心腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升，已成為致殘及病死的重要原因。動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是促使動(dòng)脈粥樣硬化的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。在內(nèi)皮細(xì)胞眾多損傷因素中，氧化應(yīng)激損傷是一個(gè)重要因素，參與了內(nèi)皮細(xì)胞損傷病理變化過程的各個(gè)環(huán)節(jié)。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及總抗氧化能力（T－AOC）等是反映氧自由基水平及生物體清除氧自由基能力的主要觀察指標(biāo)［2］。依達(dá)拉奉是臨床上唯一廣泛使用且效果優(yōu)越的新型自由基清除劑，其清除自由基的確切效果多有報(bào)道［3］。本研究旨在細(xì)胞水平上觀察依達(dá)拉奉對(duì)過氧化氫（H2O2）致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化損傷的影響，探討其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用，為其臨床用藥提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 藥物 依達(dá)拉奉標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；過氧化氫溶液（H2O2，30%）：無錫市蘇強(qiáng)化工有限公司。

1.2 試劑 M199培養(yǎng)基：GIBCO公司；胰蛋白酶：GIBCO公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；總抗氧化能力（T－AOC）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 臍帶數(shù)根，來自解放軍第154醫(yī)院婦產(chǎn)科。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HUVEC的培養(yǎng)、傳代及鑒定 依據(jù)文獻(xiàn)方法［4］，從健康足月產(chǎn)婦臍靜脈內(nèi)提取HUVEC，經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)鑒定證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。將HUVEC進(jìn)行傳代，采用生長(zhǎng)良好的3～4代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合，移去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液清洗，換用含1%的胎牛血清M199培養(yǎng)基，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。將細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組、H2O2組、依達(dá)拉奉高劑量組（40 μmol／L）、依達(dá)拉奉低劑量組（20 μmol／L），每組重復(fù)8個(gè)復(fù)孔。依達(dá)拉奉組先給予含20、40 μmol／L依達(dá)拉奉的M199培養(yǎng)液，其余2組給予M199培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，除對(duì)照組外（仍給予M199培養(yǎng)液），各組再給予含250 μmol／L H2O2培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 觀察指標(biāo) ①M(fèi)DA含量測(cè)定。處理各組HUVEC，吸取各組培養(yǎng)液1ml，按MDA測(cè)定試劑盒說明書方法測(cè)定MDA含量。②SOD的活性及TAOC水平測(cè)定。處理各組HUVEC，吸取各組培養(yǎng)液1ml，按SOD及T－AOC試劑盒說明書方法測(cè)定SOD的活性及T－AOC水平。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)MDA水平的影響 各組細(xì)胞產(chǎn)生MDA水平測(cè)定結(jié)果見表1。與空白對(duì)照組比較，H2O2組MDA明顯升高（P＜0.01）；與H2O2組比較，依達(dá)拉奉的高低劑量組MDA水平均降低，低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 依達(dá)拉奉對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HUVEC MDA水平的影響（±s，n＝8）

表1 依達(dá)拉奉對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HUVEC MDA水平的影響（±s，n＝8）

注：與H2O2組相比較，＊P＜0.05，△P＜0.01；與空白對(duì)照組相比，＃P＜0.01

組別 MDA（nmol／mg）空白對(duì)照組 0.715±0.142 H2O2組 1.619±0.245＃依達(dá)拉奉低劑量組 1.225±0.310＊依達(dá)拉奉高劑量組 1.043±0.270△

2.2 對(duì)SOD活性及T－AOC的影響 各組細(xì)胞SOD活性及T－AOC測(cè)定結(jié)果見表2。與空白對(duì)照組比較，H2O2組SOD活性及T－AOC明顯降低 （P＜0.01）。與H2O2組比較，依達(dá)拉奉的高低劑量組SOD活性及T－AOC均增高；其中依達(dá)拉奉高低劑量組SOD活性具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；依達(dá)拉奉低劑量組T－AOC有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），依達(dá)拉奉高劑量組T－AOC有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 依達(dá)拉奉對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HUVEC SOD活性及T－AOC的影響（±s，n＝8）

表2 依達(dá)拉奉對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HUVEC SOD活性及T－AOC的影響（±s，n＝8）

注：與H2O2組相比較，＊P＜0.05，△P＜0.01；與空白對(duì)照組相比，＃P＜0.01

組別 SOD（U／mg） T－AOC（U／mg）空白對(duì)照組 11.816±1.502 0.665±0.100 H2O2組 8.461±1.089＃ 0.281±0.071＃依達(dá)拉奉低劑量組 6.168±0.944△ 0.393±0.103＊依達(dá)拉奉高劑量組 6.309±1.232△ 0.463±0.105△

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的形成是由于多種危險(xiǎn)因子損傷內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)生的一系列炎性反應(yīng)，其中內(nèi)皮細(xì)胞損害是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理變化［5］。在內(nèi)皮細(xì)胞損害過程中，氧化應(yīng)激是一個(gè)重要的中間環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為氧自由基的過氧化反應(yīng)，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和核酸變性，導(dǎo)致不可逆損傷，并且脂質(zhì)過氧化會(huì)改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能和酶的功能，尤其是細(xì)胞游離鈣濃度的改變［6］。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，其含量變化間接反映了氧自由基含量的變化。因此，通過測(cè)定MDA含量可以評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱［7］。T－AOC是指機(jī)體內(nèi)總抗氧化體系的總稱，包括兩個(gè)體系：一類是酶促防御系統(tǒng)，包括SOD、過氧化物酶、過氧化氫酶等。另一類是非酶促防御系統(tǒng)，包括維生素C、維生素E、氨基酸和金屬蛋白等［8］。SOD是生物體內(nèi)專一清除超氧陰離子的特異性抗氧化酶，能夠清除氧自由基，保護(hù)機(jī)體免受自由基的攻擊［9］。因此，T－AOC及SOD活力的高低可反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力。除此之外，體內(nèi)還有許多非酶促類抗氧化劑，它們也可以通過各種方式清除氧自由基。

依達(dá)拉奉是新近開發(fā)的一種新型自由基清除藥，其分子量小，并且具有親脂基團(tuán)，血腦屏障的通透性高達(dá)60%，主要是通過抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性刺激前列環(huán)素的生成，減少炎性遞質(zhì)白三烯的產(chǎn)生，降低羥自由基的濃度，從而實(shí)現(xiàn)清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用，從而避免血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷［10］。林森等［11］對(duì)以依達(dá)拉奉治療的35例急性腦梗死患者血清SOD、MDA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)MDA水平較治療前明顯降低，SOD水平較治療前有明顯提高，提示依達(dá)拉奉對(duì)患者體內(nèi)自由基有確切的清除作用。薛慎伍等［12］將結(jié)扎離斷法制作大鼠頸動(dòng)脈的局灶性慢性腦缺血模型，造模3周后給予依達(dá)拉奉3 mg／kg腹腔注射，取各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織勻漿測(cè)定MDA和SOD的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉具有抑制缺血后血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，清除自由基，抑制腦水腫，影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可明顯升高HUVEC中MDA水平（P＜0.01），明顯降低SOD活性（P＜0.01）及TAOC（P＜0.01）， 說明H2O2可明顯造成HUVEC損傷。相對(duì)于H2O2組，依達(dá)拉奉各劑量組細(xì)胞損傷不同程度減輕，依達(dá)拉奉的低劑量組MDA水平降低（P＜0.05）， 高劑量組MDA水平明顯降低（P＜0.01）；高低劑量組SOD活性均明顯增高（P＜0.01）；低劑量組T－AOC增高（P＜0.05），而高劑量組T－AOC增高更加明顯（P＜0.01）。說明依達(dá)拉奉可增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化酶活性，對(duì)抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)其清除氧自由基，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷的作用。高劑量組依達(dá)拉奉T－AOC改善更加顯著，考慮可能與啟動(dòng)非酶促防御系統(tǒng)有關(guān)。綜上所述，依達(dá)拉奉可降低內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷程度，提高內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力，值得推廣應(yīng)用。

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