功能性消化不良脾虛證動(dòng)物模型的制作及評(píng)價(jià)

劉晶 李峰 唐旭東 馬捷 葛東宇 李根茂 劉燕 劉艷陽(yáng) 韓晨霞 吳卓耘

功能性消化不良表現(xiàn)為胃和十二指腸功能紊亂引起的癥狀，經(jīng)檢查排除引起這些癥狀的器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征［1］。根據(jù)目前國(guó)際公認(rèn)的功能性胃腸病診斷標(biāo)準(zhǔn)—羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)，功能性消化不良必須包括以下癥狀的一條或多條:(1)餐后飽脹不適;(2)早飽感;(3)上腹痛;(4)上腹燒灼感。并且沒(méi)有可以解釋上述癥狀的功能性疾病。同時(shí)還應(yīng)滿足診斷前，癥狀出現(xiàn)至少6 個(gè)月，近3 個(gè)月符合以上標(biāo)準(zhǔn)［2］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，功能性消化不良可與“痞滿”對(duì)應(yīng)，其中脾氣虛證是“痞滿”一病的重要證型。根據(jù)其辨證標(biāo)準(zhǔn)［3-5］，“痞滿”脾氣虛證主癥是:脘腹痞滿或脹痛，食少納呆。次癥表現(xiàn)為納少泛惡，噯氣呃逆，大便稀溏，疲乏無(wú)力，舌淡，苔薄白，脈細(xì)弦。根據(jù)上述診斷及辨證標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)功能性消化不良脾虛證動(dòng)物模型進(jìn)行復(fù)制及評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Spargue-Dawley 雄性乳鼠45 只，7日齡，帶母鼠，每只母鼠帶5 只乳鼠，為其提供母乳。母鼠與所帶乳鼠為一籠，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，12 小時(shí)節(jié)律，室溫22℃，濕度:60% ～70%。母鼠以全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)科技有限公司提供。［許可證號(hào):SYXK(京)2012-0001］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

1.2.1 自制改良多平臺(tái)箱 改良多平臺(tái)箱(110 cm×60 cm×40 cm)中固定15 個(gè)平臺(tái)(直徑6.5 cm，高8.0 cm)，在平臺(tái)周邊注滿水，水溫22℃，水面低于平臺(tái)表面1.0 cm。大鼠放置在箱內(nèi)平臺(tái)上，可以在平臺(tái)間活動(dòng)，可自由飲食飲水，但無(wú)法正常休息，進(jìn)而誘發(fā)大鼠疲勞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 碘乙酰胺，由西奧格瑪公司提供;蔗糖，由拜爾迪公司提供。

1.3 功能性消化不良脾虛證動(dòng)物模型的復(fù)制

模型復(fù)制參考功能性消化不良碘乙酰胺造模法［6］及改良多平臺(tái)造模法［7］。

實(shí)驗(yàn)步驟:(1)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，12 小時(shí)晝夜節(jié)律，室溫22℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)母鼠，并由母鼠提供母乳給乳鼠。(2)乳鼠10日齡，將乳鼠按籠隨機(jī)分成2組，蔗糖組(15 只)，碘乙酰胺干預(yù)組(30 只)。蔗糖組每天以2%蔗糖溶液對(duì)乳鼠進(jìn)行灌胃，0.2 mL/只，連續(xù)6 天。碘乙酰胺干預(yù)組每天以0.1%碘乙酰胺蔗糖溶液對(duì)乳鼠灌胃，蔗糖溶液濃度為2%，0.2 mL/只，連續(xù)6 天。之后正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件較之前不變。(3)飼養(yǎng)大鼠至3 周齡，斷奶，剔除母鼠。并將大鼠分籠，每籠5 只，改用常規(guī)飼料飼養(yǎng)。(4)大鼠飼養(yǎng)至6 周齡，再次將實(shí)驗(yàn)大鼠分組。正常組(15 只):為之前以蔗糖溶液灌胃的大鼠;將碘乙酰胺干預(yù)組大鼠按體重隨機(jī)分成2 組，模型1 組(15 只)，模型2組(15 只)。正常組與模型1 組正常飼養(yǎng)，模型2 組每天放入注水的平臺(tái)箱內(nèi)(18∶00 ～8∶00)進(jìn)行疲勞誘發(fā)，連續(xù)14 天。箱內(nèi)水每天更換，水溫維持22℃。

1.4 功能性消化不良脾虛證動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

1.4.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 每天對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠整體狀態(tài)進(jìn)行肉眼觀察，觀察大鼠皮毛色澤，耳廓顏色，精神狀態(tài)及活動(dòng)度，同時(shí)記錄大鼠體重變化。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)大鼠病理學(xué)檢查 碘乙酰胺干預(yù)結(jié)束及小平臺(tái)站立結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取2 只大鼠，觀察大鼠胃病理學(xué)改變。

1.4.3 大鼠飲食情況統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)收集期間，每組隨機(jī)抽取10 只大鼠單籠飼養(yǎng)，記錄大鼠一天食物及飲水的消耗量。

1.4.4 糖水偏好試驗(yàn) 大鼠模型復(fù)制結(jié)束后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)［8-10］。每組隨機(jī)抽取10只大鼠，進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)前，對(duì)大鼠進(jìn)行糖水適應(yīng)性訓(xùn)練。訓(xùn)練期間，大鼠單籠飼養(yǎng)，籠上同時(shí)放置兩個(gè)水瓶，一瓶為1%的蔗糖溶液，另一瓶為正常飲用水。每隔12 小時(shí)，兩個(gè)水瓶左右互換。訓(xùn)練連續(xù)進(jìn)行48 小時(shí)。訓(xùn)練結(jié)束后，僅供應(yīng)飲用水6 小時(shí)，隨后禁食水18 小時(shí)，此后進(jìn)入試驗(yàn)階段。試驗(yàn)期間，保持大鼠單籠飼養(yǎng)，每籠上再次放置1%的蔗糖溶液及正常飲用水，持續(xù)3 小時(shí)。記錄糖水及飲用水試驗(yàn)前后重量差值。計(jì)算糖水偏好百分比。糖水偏好百分比(SP)=糖水消耗量(g)÷［糖水消耗量(g)+飲用水消耗量(g)］。統(tǒng)計(jì)SP＞75%大鼠在本組中所占百分比，各組比較運(yùn)用卡方檢驗(yàn)。

1.4.5 胃腸敏感性試驗(yàn) 模型復(fù)制結(jié)束后，大鼠進(jìn)行胃腸敏感性試驗(yàn)［6，11］。大鼠模型復(fù)制結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3 只大鼠，進(jìn)行胃腸敏感性試驗(yàn)。試驗(yàn)前，大鼠禁食18 小時(shí)。1%戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，按大鼠體重0.4 mL/100g 腹腔注射。切開(kāi)大鼠腹部，曝露胃。在大鼠胃部作一切口，將氣囊植入胃底部。氣囊一端閉合，另一端接一PE 管。縫合胃切口，PE 管留在胃外，埋入皮下。縫合腹部切口。術(shù)后，大鼠單籠飼養(yǎng)，恢復(fù)一周。一周后，將PE 管從大鼠皮下取出，接壓力計(jì)。將電極植入大鼠斜方肌肌群。用壓力計(jì)向大鼠胃內(nèi)氣囊充氣，氣囊擴(kuò)張分別至10 mmHg、20 mmHg、30 mmHg、40 mmHg、50 mmHg這5 個(gè)數(shù)值，每次擴(kuò)張持續(xù)20 秒，間隔2分鐘，同時(shí)檢測(cè)在此胃內(nèi)壓下的斜方肌肌電變化。統(tǒng)計(jì)大鼠肌電變化率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組數(shù)據(jù)，每組均成正態(tài)分布，采用方差分析。組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)。P ＜0.05 具有顯著性差異;P ＜0.01 為極顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較正常組大鼠皮毛不澤，耳廓顏色較淡，懶惰嗜臥，活動(dòng)度低。其中模型2 組較模型1 組更為明顯。

2.2 大鼠體重變化

大鼠6 周齡時(shí)，即碘乙酰胺干預(yù)32 天后，將碘乙酰胺組大鼠按體重隨機(jī)分組，對(duì)模型2 組進(jìn)行小平臺(tái)干預(yù)，并記錄大鼠體重變化。小平臺(tái)干預(yù)期間，正常組與模型1 組大鼠體重比較無(wú)顯著差異(P＞0.1)，小平臺(tái)干預(yù)后第7 天，模型2 組大鼠體重明顯低于正常組及模型1 組(P ＜0.01)，此差異一直持續(xù)至小平臺(tái)干預(yù)結(jié)束。見(jiàn)表1。

表1 小平臺(tái)干預(yù)后大鼠體重變化(±s，g，n=15)

表1 小平臺(tái)干預(yù)后大鼠體重變化(±s，g，n=15)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型1 組比較，bP ＜0.01

時(shí)間 正常組 模型1 組 模型2組209.8 ±6.67 201.2 ±4.21 206.6 ±5.45第7 天 242.3 ±8.13 239.4 ±4.50 206.4 ±6.34ab第14 天 288.1 ±9.79 303.5 ±4.77 219.4 ±8.96第0 天ab

2.3 大鼠胃病理切片

如圖所示，碘乙酰胺干預(yù)后，幼年大鼠胃組織與蔗糖組比較除黏膜表面略有疏松外，無(wú)明顯變化，未見(jiàn)深層損傷及炎性浸潤(rùn)，如圖1。大鼠成年后，模型1 組與正常組比較，組織也無(wú)明顯差異。小平臺(tái)干預(yù)組(模型2 組)胃未見(jiàn)損傷及炎性浸潤(rùn)，胃組織與正常組，模型1 組比較也無(wú)明顯差異。各組均未見(jiàn)胃損傷(如圖2)。

圖1 碘乙酰胺干預(yù)后大鼠胃病理

2.4 大鼠進(jìn)食量及飲水量統(tǒng)計(jì)

小平臺(tái)結(jié)束后，記錄各組大鼠進(jìn)食量及飲水量。模型1 組及模型2 組大鼠進(jìn)食量均明顯低于正常組(P ＜0.05)，與正常組及模型1 組比較，模型2組進(jìn)食量減少更為顯著(P ＜0.01)。各組大鼠飲水量情況與進(jìn)食情況相似，兩模型組飲水量均低于正常組(P ＜0.05)，且模型2 組較正常組，模型1 組減少更為顯著(P ＜0.01)。如表2。

表2 各組大鼠飲食情況統(tǒng)計(jì)(±s，n=10)

表2 各組大鼠飲食情況統(tǒng)計(jì)(±s，n=10)

注:與正常組比較，aP ＜0.05;與正常組比較，bP ＜0.01;與模型1 組比較，cP ＜0.01

組別 進(jìn)食量(g) 飲水量(g)21.5 ±0.58 39.2 ±2.3模型1 組 19.5 ±0.43a 30.0 ±1.52a模型2 組 15.4 ±0.79bc 27.3 ±3.34正常組bc

2.5 糖水偏好試驗(yàn)

每組隨機(jī)抽取10 只，進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)。各組大鼠糖水消耗量比較，無(wú)顯著差異(P＞0.1)。但各組大鼠，糖水偏好百分比＞75%大鼠只數(shù)占各組總數(shù)百分比有明顯差異，模型1 組與模型2 組均顯著低于正常組(P ＜0.01)。如表3。

表3 各組大鼠糖水偏好試驗(yàn)(±s，n=10)

表3 各組大鼠糖水偏好試驗(yàn)(±s，n=10)

注:與正常組比較，aP ＜0.01

組別 糖水消耗量(g) SP＞75%(只) 百分比(%)22.5 ±3.52 8 80模型1 組 15.9 ±1.57 1 10a模型2 組 17.0 ±5.42 2 20正常組a

2.6 胃腸敏感性試驗(yàn)

向大鼠胃部植入的氣囊充氣，檢測(cè)不同胃內(nèi)壓下，大鼠頸部肌電變化率。在胃內(nèi)壓10 mmHg，三組肌電變化率比較無(wú)顯著性差異(P＞0.1)，至20 mmHg時(shí)，兩模型組肌電變化率較正常組明顯升高(P ＜0.01)，但兩模型組之間比較無(wú)顯著差異(P＞0.1)。30 mmHg 時(shí)，三組比較與20 mmHg 一致;40 mmHg時(shí)，模型1 組與正常組比較有極顯著性差異(P ＜0.01)，模型2 組與正常組比較有顯著性差異(P ＜0.05)，兩模型組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.1)。50 mmHg 時(shí)，兩模型組與正常組比較有顯著差異(P ＜0.05)，兩模型組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.1)。模型組大鼠肌電變化率在30 mmHg 達(dá)到峰值，之后變化率開(kāi)始減小。正常組大鼠肌電變化率在40 mmHg時(shí)達(dá)到峰值，之后變化率開(kāi)始減小。如表4及圖3。

表4 不同胃內(nèi)壓下大鼠頸部肌電變化率(±s)

表4 不同胃內(nèi)壓下大鼠頸部肌電變化率(±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與正常組比較，bP ＜0.05

擴(kuò)張壓力 正常組 模型1 組 模型2組70 20mmHg 179.30 ±22.46 282.49 ±17.22a 288.83 ±34.53a 30mmHg 254.93 ±30.05 420.12 ±29.15a 412.55 ±61.85a 40mmHg 315.41 ±20.17 412.35 ±33.53a 378.80 ±23.87b 50mmHg 265.80 ±34.06 333.88 ±39.09b 345.23 ±14.36 10mmHg 103.15 ±4.69 114.94 ±13.53 114.56 ±14.b

圖3 肌電變化率及示意圖

3 討論

功能性消化不良是西醫(yī)病名，診斷要點(diǎn)包括:(1)餐后飽脹不適，早飽感，上腹痛，上腹燒灼感至少出現(xiàn)1 項(xiàng)或多項(xiàng);(2)慢性起病，病癥持續(xù)至少6個(gè)月;(3)排除其它器質(zhì)性疾病。功能性消化不良包括兩個(gè)亞型。其中以中等程度上腹痛為主要癥狀的，稱為上腹痛綜合征，以餐后上腹部飽脹不適為主要癥狀的，稱為餐后不適綜合征。有研究發(fā)現(xiàn)，功能性消化不良上腹痛綜合征患者的胃順應(yīng)性降低較健康人明顯，而餐后不適綜合征患者在胃敏感性增高方面更為顯著［12］。

中醫(yī)內(nèi)科學(xué)將功能性消化不良?xì)w入“痞滿”的范疇。研究功能性消化不良中醫(yī)學(xué)證候分布發(fā)現(xiàn)，各中醫(yī)證型共有癥狀為腹脹［13］。而根據(jù)西醫(yī)學(xué)的疾病診斷，單純的上腹痛綜合征并不包括腹脹這一癥狀。因此，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為的功能性消化不良(痞滿)，應(yīng)屬于西醫(yī)餐后不適綜合征的范疇，伴或不伴有上腹痛綜合征。根據(jù)中醫(yī)功能性消化不良(痞滿)脾胃虛弱證的辨證標(biāo)準(zhǔn)［3-5］，其主癥為脘腹痞滿或脹痛，食少納呆，次癥為惡心，噯氣，呃逆，疲乏無(wú)力，舌淡，苔薄白，脈細(xì)弦。

因此功能性消化不良脾虛證動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，首先應(yīng)符合羅馬Ⅲ功能性消化不良診斷標(biāo)準(zhǔn)，其次應(yīng)符合中醫(yī)脾胃虛弱證中的上腹脹，食少，食欲減退三大主癥。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)選擇了國(guó)際上使用的碘乙酰胺造模法作為功能性消化不良模型［6］，對(duì)幼年大鼠胃進(jìn)行刺激，從而降低成年大鼠胃功能。同時(shí)，根據(jù)中醫(yī)“脾主肌肉”，“勞倦傷脾”理論，復(fù)合小平臺(tái)站立因素，誘發(fā)大鼠疲勞，進(jìn)而加重脾虛。

圍繞中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。本次研究造模周期為46 天，符合功能性消化不良慢性起病的標(biāo)準(zhǔn)。而對(duì)胃組織染色發(fā)現(xiàn)，模型組未出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)及深層損傷，排除胃炎及胃潰瘍等引起該癥狀的器質(zhì)性疾病。從飲食情況來(lái)看，模型組較正常組飲食顯著減少，其中以模型2 組減少更為明顯，這一結(jié)果符合中醫(yī)脾虛證中的“食少”一癥。糖水偏好試驗(yàn)反映大鼠對(duì)喜愛(ài)食物的興趣程度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠糖水偏好百分比＞75%，在本組中所占百分比較正常組明顯降低，結(jié)合進(jìn)食量減退，可以反應(yīng)大鼠食欲下降情況。這一癥狀也符合功能性消化不良脾虛證納呆這一主癥。上腹脹是功能性消化不良脾虛證最重要的主癥，研究發(fā)現(xiàn)，上腹脹可能與胃對(duì)機(jī)械擴(kuò)張敏感性增高有關(guān)［12］。臨床中也用球囊試驗(yàn)檢測(cè)胃功能。本次研究中，借用球囊試驗(yàn)檢測(cè)大鼠胃敏感性，研究發(fā)現(xiàn)在同等胃內(nèi)壓的條件下，兩模型組大鼠均對(duì)胃內(nèi)擴(kuò)張的感受更為敏感，反映了大鼠胃敏感性增高。另外，兩模型組大鼠出現(xiàn)感覺(jué)至不能耐受的胃內(nèi)壓變化較正常組明顯降低，在一定程度上反應(yīng)了模型組胃順應(yīng)性降低，其中以施加小平臺(tái)因素的模型2 組較為明顯。球囊試驗(yàn)反映了大鼠腹脹及早飽方面的程度，結(jié)果顯示，模型組大鼠可出現(xiàn)腹脹，早飽樣癥狀，符合功能性消化不良脾虛證主癥。

從功能性消化不良脾虛證中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，兩模型組均符合疾病脾虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但兩組在一些指標(biāo)上還有差異。首先，施加小平臺(tái)因素的模型2 組大鼠體重顯著低于正常組及模型1 組;其次，模型2 組大鼠飲食減少較模型1 組更為顯著。另外，從功能性消化不良脾虛證次癥來(lái)看，模型組大鼠較正常組大鼠皮毛不澤，耳廓顏色較淡，懶惰嗜臥，活動(dòng)度低。其中模型2 組較模型1 組更為明顯。這些符合脾虛證疲乏無(wú)力，面色少華的特點(diǎn)，而模型2 組這些特點(diǎn)更為明顯。

綜上，從功能性消化不良脾虛證主癥來(lái)看，碘乙酰胺干預(yù)的模型1 組與復(fù)合小平臺(tái)勞倦因素的模型2 組，均符合功能性消化不良脾虛證動(dòng)物模型。從次癥來(lái)看，模型1 組與模型2 組分屬于脾虛證的不同亞型。李東垣在《脾胃論》中提到:“脾胃均虛，則不能食而瘦，或少食而肥?！北狙芯恐?，模型1 組符合“少食而肥”的脾虛證，而模型2 組符合“不能食而瘦”的脾虛證，而施加勞倦因素的模型2 組脾虛證表征更為明顯。這一研究所建立的模型，將為功能性消化不良脾虛證的深入研究提供動(dòng)物模型支持。

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