四川北部地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)ESBLs CTX-M亞型研究

黃義山蔡燕易成鳳嚴(yán)成燕蘇忠龍廖濤陳金文趙明才熊元

四川北部地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)ESBLs CTX-M亞型研究

黃義山1蔡燕1易成鳳2嚴(yán)成燕2蘇忠龍1廖濤1陳金文1趙明才1熊元1

【摘要】目的 了解川北地區(qū)臨床分離的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶( ESBLs）CTX-M型亞型的分布情況。方法 選取CTX-M型的42株大腸埃希菌和14株肺炎克雷伯菌作為研究對(duì)象，對(duì)PCR擴(kuò)增CTX-M耐藥基因陽(yáng)性者行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Genebank中進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果 42株大腸埃希菌中有30株出現(xiàn)CTX-M基因陽(yáng)性條帶，6株弱陽(yáng)性；14株肺炎克雷伯菌，5株出現(xiàn)CTX-M陽(yáng)性條帶，2株弱陽(yáng)性。ESBLs分子表型流行以CTX-M-14型為主，其次為CTX-M-3型,且發(fā)現(xiàn)1株OXY-2型；VITEK AES耐藥表型判斷的準(zhǔn)確性達(dá)76.8%。結(jié)論 川北地區(qū)ESBLs分子表型中CTX-M-14型流行情況嚴(yán)重，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)消毒隔離措施和流行菌株的控制。

【關(guān)鍵詞】超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；CTX-M基因型；大腸埃希菌；肺炎克雷伯菌

作者單位：1 637000四川，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2 637000四川，川北醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系

南充市科學(xué)技術(shù)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)局，項(xiàng)目基金號(hào)：14A0049

近年來(lái)，在第三代（超廣譜）頭孢菌素選擇性壓力下，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的菌株不斷增加，這些菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，最常見(jiàn)于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。我國(guó)由于頭孢噻肟和頭孢曲松的大量使用，臨床分離到的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌往往表現(xiàn)為對(duì)頭孢噻肟耐藥而對(duì)頭孢他啶敏感的不典型的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，主要為CTX-M型和SHV型[1]，而CTX-M型又有多種亞型。為了解川北地區(qū)CTX-M亞型的分布情況，對(duì)我院臨床分離得到的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)CTM-X型ESBL進(jìn)行基因型檢測(cè)，以了解其流行分布情況。

1　資料與方法

1.1菌株來(lái)源

收集2012年1月～2012年6月我院住院及門(mén)診感染患者送檢的痰、中段尿、胸腹水和各種創(chuàng)面分泌物中分離出，經(jīng)Vitek-32儀器鑒定為CTX-M型的大腸埃希菌42株和肺炎克雷伯菌14株,按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第2版常規(guī)培養(yǎng)分離并于-70℃冰箱保存菌株.

1.2方法

將凍存的菌株復(fù)蘇后，制作細(xì)菌DNA模板。根據(jù)參考文獻(xiàn)引物[2]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后Bio．Rad凝膠成像儀檢測(cè)。每組選取一株CTX-M基因擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Genebank經(jīng)比對(duì)確定其基因型。

2　結(jié)果

2.1CTX-M PCR擴(kuò)增結(jié)果

42株大腸埃希菌經(jīng)儀器檢測(cè)可疑產(chǎn)ESBLs的菌株經(jīng)CTX-M特異性引物擴(kuò)增后，有30株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，6株弱陽(yáng)性；14株肺炎克雷伯菌，5株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，2株弱陽(yáng)性，所有結(jié)果均重復(fù)試驗(yàn)，兩次結(jié)果均無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 部分CTX-M型陽(yáng)性PCR產(chǎn)物電泳圖

M：Marker 2 000，泳道1-16為部分菌株CTX-M引物擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道2、14、16為弱陽(yáng)性，其余在544 bp左右出現(xiàn)的條帶均為CTX-M型陽(yáng)性。

2.2ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 部分菌株ERIC-PCR電泳圖

表1 CTX-M基因的兩種PCR擴(kuò)增方法比較（株）

根據(jù)條帶位置完全一致判斷為同一克隆株[3]，5株肺炎克雷伯菌屬于獨(dú)立基因型；30株大腸埃希菌分為20個(gè)組，15株屬獨(dú)立基因型,共25組，部分電泳圖左邊6株為肺炎克雷伯菌，右邊11株為大腸埃希菌。見(jiàn)圖2。

2.3CTX-M基因型測(cè)序結(jié)果

PCR擴(kuò)增CTX-M基因，經(jīng)方法1擴(kuò)增出的基因產(chǎn)物，25株有9株測(cè)序成功；于是采用方法2，11株擴(kuò)增成功的產(chǎn)物有10株測(cè)序成功。其擴(kuò)增過(guò)程中各階段的溫度和反應(yīng)時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)均與方法1相同。見(jiàn)表1。

用兩種方法共測(cè)序成功19株,測(cè)序結(jié)果在Genebank經(jīng)DNA ssist 1.02比對(duì)，結(jié)果顯示共有3種序列，其中16株（包括13株大腸埃希菌和3株肺炎克雷伯菌）序列與CTX-M-14、125、65、24、104、90、130比對(duì)一致，2株（兩種細(xì)菌各占1株）序列與CTX-M-3、136、22、116、15、32比對(duì)一致，1株肺炎克雷伯菌序列與OXY-2比對(duì)一致。

3　討論

我國(guó)CTX-M檢出率在許多地方均較高，本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室經(jīng)Vitek-32微生物分析儀檢測(cè)提示為CTX-M型的42株大腸埃希菌和14株肺炎克雷伯菌用CTX-M基因特定引物擴(kuò)增，大腸埃希菌有30株出現(xiàn)CTX-M基因陽(yáng)性條帶，6株弱陽(yáng)性；肺炎克雷伯菌有5株出現(xiàn)CTX-M陽(yáng)性條帶，2株弱陽(yáng)性，總體陽(yáng)性擴(kuò)增率為76.8%。

CTX-M PCR采用方法1擴(kuò)增后，條帶之間強(qiáng)弱有明顯差異，重復(fù)擴(kuò)增，條帶強(qiáng)弱并無(wú)明顯改變，3株強(qiáng)度較弱的條帶最終測(cè)序也失??；采用方法2行CTX-M PCR擴(kuò)增后，條帶強(qiáng)度較一致，且較明顯，但方法1中呈弱陽(yáng)性的用方法2擴(kuò)增后卻為陰性，由此可見(jiàn)，該基因PCR擴(kuò)增條件除與溫度和時(shí)間等可控因素有關(guān)外，或許還與地域環(huán)境等其它未知因素有關(guān)。

根據(jù)近兩年各個(gè)地方分析的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs基因型可知，我們國(guó)家以CTX-M-14型最為常見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)將CTX-M基因擴(kuò)增成功的菌株采用ERIC-PCR初步將30株大腸埃希菌分為20個(gè)基因型，5株肺炎克雷伯菌各為一型。每型選取一株CTX-M PCR產(chǎn)物測(cè)序，最終結(jié)果顯示，川北地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要以CTX-M-14型為主，其次為CTX-M-3型，值得一提的是本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1株肺炎克雷伯菌序列與OXY-2比對(duì)一致。而各種亞型間耐藥性是否存在差異將在下一步實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步分析比較。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳賢云，夏春，薛蓮． 產(chǎn)超廣譜B-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布及耐藥性分析[J]． 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（20）：2397-2398．

[2] 張玲，曹銀元. 大腸埃希菌臨床分離株CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21（9）：836-837.

[3] 陳定強(qiáng)，彭玉婷，羅毓婷，等. 多重耐藥菌中β-內(nèi)酰胺酶的基因型研究[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（1）：1-3.

Study on Sichuan North Area Enterobacteriaceae Bacteria subType
of Produce ESBLs CTX-M

HUANG Yishan1CAI Yan1YI Chengfeng2YAN Chengyan2SU Zhonglong1LIAO Tao1CHEN Jinwen1ZHAO Mingcai1XIONG Yuan21 North Sichuan Medical College Affiliated Hospital Laboratory Department in Sichuan Province, Sichuan 637000, China 2 North Sichuan Medical College Test System in Sichuan Province, Sichuan 637000,China

[Abstract]Objective To investigate north area the clinical isolates of escherichia coli and klebsiella pneumoniae producing extended spectrum B- lactamases (ESBLs) distribution of CTX-M-type subtype. Methods Selected 42 CTX-M-type escherichia coli and 14 klebsiella pneumoniae as the research object, CTX-M-positive resistance gene was amplified by PCR for DNA sequencing, sequencing results were compared in the Genebank. Results 30 CTX-M gene positive bands appeared in 42 E.coli, 6 had weakly positive, 5 appear CTX-M positive bands in 14 klebsiella pneumoniae, 2 had weakly positive. ESBLs molecular phenotype popular with CTX-M-14 type, followed by the CTX-M-3 type, and found an OXY-2 type, VITEK AES resistant phenotype to determine the accuracy of up to 76.8%. Conclusion The North Region ESBLs molecular phenotype in CTX-M-14-type epidemic situation is serious, it should further strengthen disinfection and isolation measures and control of the epidemic strain.

[Key words]Extended-spectrum β-lactamase, CTX-Mgenotypes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.13.015

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）13-0020-02

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R181.3