海膽黃多糖SEP抑制高糖高胰島素誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大

周慶峰，劉純慧，王洪新

(1.商丘師范學(xué)院生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南商丘　476000;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南　250100; 3.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州　121001)

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海膽黃多糖SEP抑制高糖高胰島素誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大

周慶峰1，劉純慧2，王洪新3

(1.商丘師范學(xué)院生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南商丘476000;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250100; 3.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州121001)

摘要:目的觀察海膽黃多糖SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的影響，并初步探索其作用機(jī)制。方法利用高糖高胰島素模擬糖尿病機(jī)體微環(huán)境誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型，選擇不同劑量海膽黃多糖SEP分組給藥處理后，采用Lowrys法檢測(cè)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量;利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積變化;采用RT-PCR法檢測(cè)給藥前后心肌細(xì)胞ANF和PPAR-α mRNA表達(dá)變化。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，高糖高胰島素組蛋白含量、細(xì)胞表面積、ANF和PPAR-α mRNA表達(dá)均明顯增加;與高糖高胰島素組相比，低、中、高給藥組劑量依賴性降低了高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的蛋白含量、細(xì)胞表面積、以及ANF和PPAR-α mRNA表達(dá)。結(jié)論SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大具有一定的抑制作用，PPAR-α信號(hào)通路可能參與了這一過(guò)程。

關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞;肥大;乳鼠;高糖高胰島素;多糖;SEP

糖尿病心肌病主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和纖維化，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，危害性大［1］。海膽黃多糖(polysaccharide from the eggs of S.nud?us，SEP)是從光棘球海膽的卵中分離到的一種水溶性多糖，具有明顯促脾淋巴細(xì)胞增殖和抗腫瘤作用［2－3］。已有研究表明，黃芪多糖、人參多糖等多糖類藥物可產(chǎn)生抑制心肌細(xì)胞肥大作用［4－5］，然而海膽黃多糖SEP是否對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大也具有保護(hù)作用，目前仍尚不明確。

糖尿病患者長(zhǎng)期處于高糖和高胰島素內(nèi)環(huán)境，可直接促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白的合成進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大，故采用高糖和高胰島素處理體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，可在一定程度上模擬糖尿病心肌肥大的病理環(huán)境［6］。因此，本研究首先采用高糖高胰島素體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)而采用海膽黃多糖SEP處理高糖高胰島素培養(yǎng)下所誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞，觀察海膽黃多糖SEP對(duì)肥大心肌細(xì)胞的蛋白含量、細(xì)胞表面積以及心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF) mRNA表達(dá)的影響，而ANF是心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志性因子［7］。

最新研究表明過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α (peroxisome pro1iferator-activated receptors，PPAR-α)參與了高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程［8］，因此，本研究采用定量PCR技術(shù)分析SEP對(duì)RRAR-α mRNA表達(dá)的影響，初步探索SEP影響心肌細(xì)胞肥大的可能信號(hào)通路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生2 d的SD大鼠乳鼠，♀♂不拘，由商丘師范學(xué)院生科院提供。

1.2藥品與試劑Trypsin、SDS、DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖、胰島素均為Sigma公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;小牛血清為杭州四季青生物材料研究所產(chǎn)品; TRIozol Reagent為寶生物工程有限公司產(chǎn)品;引物合成由南京金斯瑞上生物技術(shù)有限公司完成，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3海膽黃多糖SEP的制備海膽黃多糖多糖SEP的制備按照劉純慧等［8］研究方法完成。

1.4體外乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)取出生2－3 d 的SD大鼠乳鼠，無(wú)菌條件下開胸取出心臟，DHanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，加入0.6 g·L－1胰蛋白酶消化細(xì)胞，根據(jù)差速貼壁法獲得較純的心肌細(xì)胞，以1×108·L－1的密度送入通以體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2及0.95空氣的二氧化碳孵箱中培養(yǎng)［9］。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后，換液為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板上的細(xì)胞分為6組，換培養(yǎng)基的同時(shí)給藥，每組給藥如下:第1組為正常對(duì)照組;第2組為給予25.5 mmol·L－1葡萄糖和0.1μmol·L－1胰島素的高糖高胰島素組;第3組為在第2組基礎(chǔ)上加入1 mg·L－1的低劑量SEP組;第4組為10 mg·L－1的中劑量SEP 組;第5組為100 mg·L－1的高劑量SEP組;第6組為100 mg·L－1的高劑量黃芪多糖(APS)組;給藥48 h后 進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.6培養(yǎng)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的測(cè)定吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks液快速?zèng)_洗3次后，加入10 g·L－1SDS (十二烷基硫酸鈉) 0.5 mL溶解細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)，Lowrys法測(cè)每孔細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。

1.7培養(yǎng)心肌細(xì)胞表面積測(cè)量采用計(jì)算機(jī)CIAS大恒細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(400×)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的直徑，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的表面積。每孔隨機(jī)選擇7個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)10個(gè)細(xì)胞。

1.8ANF和PPAR-α mRNA的表達(dá)檢測(cè)分析心肌細(xì)胞肥大通常伴有ANF的表達(dá)，因此本研究通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大時(shí)ANF mRNA的表達(dá)，作為反映觀測(cè)心肌細(xì)胞肥大的參考指標(biāo)［10］。參照文獻(xiàn)及GenBank中大鼠相應(yīng)基因序列，采用TRIzol提取心肌細(xì)胞總RNA，按說(shuō)明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分析，以β-actin為內(nèi)參，采用ANF和PPAR-αmRNA與β-actin吸光度比值變化來(lái)衡量SEP對(duì)目標(biāo)基因mRNA表達(dá)的影響，比值越高，代表基因表達(dá)量越高。

2　結(jié)果

2.1SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的蛋白含量的影響各組間分別加入不同影響因素處理48 h后，用Lowrys法測(cè)定每孔細(xì)胞的OD值。與正常對(duì)照組相比，高糖高胰島素組心肌細(xì)胞蛋白含量增加了38.8% (P＜0.01)，與高糖高胰島素組相比，SEP低、中、高劑量組心肌細(xì)胞蛋白含量分別減少了5.6% (P＜0.05)、13.8% (P＜0.01)和15.5%(P＜0.01)，差異具有顯著性，表明不同劑量組SEP均能有效減少肥大心肌細(xì)胞的蛋白含量，隨著給藥劑量的增加，SEP抑制肥大心肌細(xì)胞蛋白含量的能力逐步增強(qiáng)，APS處理組與高糖高胰島素組相比，心肌細(xì)胞蛋白含量減少了24.0%(P＜0.01)，差異亦有顯著性。與同劑量SEP組相比，APS給藥組的蛋白含量減少了10.1%，抑制效果更為明顯(P ＜0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of SEP on cellular protein content of hypertrophic heartcells of neonatal rats induced with high glucose and high insulin

2.2SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的細(xì)胞表面積的影響各組間分別加入不同影響因素處理48 h后，用圖像處理系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞的表面積。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，高糖高胰島素組心肌細(xì)胞表面積增加了39.9 % (P＜0.01) ;與高糖高胰島素組相比，1、10、100 mg·L－1劑量SEP給藥組的心肌細(xì)胞表面積分別減少了6.2 %、8.5 %和9.7 %(P＜0.01)，差異有顯著性; APS處理組與高糖高胰島素組相比，心肌細(xì)胞表面積減少了15.3% (P＜0.01)，差異亦有顯著性。以上數(shù)值表明各劑量組SEP均能有效減少肥大心肌細(xì)胞的表面積。與同劑量SEP給藥組相比，100 mg·L－1APS給藥組的蛋白含量減少了6.2%，抑制能力更為明顯，P ＜0.01，見Tab 2。

Tab 2 Effects of SEP on cellular volume of hypertrophic heart cells of neonatal rats induced with high glucose and high insulin

2.3SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞ANF mRNA表達(dá)的影響在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量SEP和黃芪多糖作用48 h后。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖高胰島素組ANF/β-actin吸光度比值升高了83%，表明ANF mRNA表達(dá)量明顯升高。同時(shí)，與高糖高胰島素組相比，不同濃度SEP給藥組ANF/β-actin吸光度比值分別減少了15%、37%和39% (P＜0.01)，表明隨著給藥劑量的增加，1、10、100 mg·L－1劑量SEP給藥組抑制ANF mRNA表達(dá)效果逐漸升高(Fig 1)。

Fig 1 Effect of SEP on expression ANF mRNA of hypertrophic heart cells of neonatal rats inducedwith high glucose and high insulin

2.4SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞PPAR-α mRNA表達(dá)的影響在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量SEP和黃芪多糖作用48 h后，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞PPAR-α mRNA/β-actin吸光度比值升高了79%。與對(duì)照組相比，1、10、100 mg·L－1劑量SEP給藥組PPAR-α mRNA/β-actin吸光度比值分別降低了21%、43%和62%(P＜0.01)，表明隨著給藥劑量的升高，PPAR-α mRNA表達(dá)量逐漸降低(Fig 2)。

Fig 2 Effect of SEP on expression PPAR-α mRNA of hypertrophic heart cells of neonatal rats induced withhigh glucose and high insulin

3　討論

既往研究表明，高糖高胰島素直接參與了誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大的形成過(guò)程［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用25.5 mmol·L－1葡萄糖與0.1 μmol·L－1的胰島素體外模擬高糖高胰島素血癥環(huán)境，來(lái)觀察海膽黃多糖SEP是否對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。結(jié)果表明，海膽黃多糖SEP能劑量依賴性減少肥大心肌細(xì)胞蛋白含量、細(xì)胞表面積和ANF mRNA的表達(dá)。同時(shí)，我們選擇了黃芪多糖作為陽(yáng)性對(duì)照組，與海膽黃多糖SEP相比，黃芪多糖對(duì)肥大心肌細(xì)胞的抑制作用更為明顯，但海膽黃多糖SEP在體外糖尿病心肌細(xì)胞肥大模型中也展現(xiàn)了一定的抑制細(xì)胞肥大作用，這一結(jié)果提示我們SEP有潛力成為一種糖尿病心肌肥大治療的輔助藥物。

PPAR-α是一種主要分布在心臟、肝臟、腎臟等重要器官的核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、心血管氧化應(yīng)激等過(guò)程具有一定的調(diào)控作用［12］，有研究表明其可通過(guò)抑制NF-κB而減輕心肌肥厚［13］。然而海膽黃多糖SEP是否也通過(guò)影響PPAR-α信號(hào)通路來(lái)產(chǎn)生抑制心肌細(xì)胞肥大的作用?目前仍尚不明確。為進(jìn)一步探索SEP影響高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制，我們同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了不同劑量組SEP給藥情況下PPAR-α mRNA的表達(dá)水平變化，結(jié)果表明，SEP給藥后可一定程度上改善了心肌細(xì)胞肥大情況，同時(shí)PPAR-αmRNA的表達(dá)水平也隨著SEP給藥劑量逐漸減少，這表明PPAR-α信號(hào)通路很可能參與了高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生。

總之，本實(shí)驗(yàn)首次在細(xì)胞水平上證明了海膽黃多糖SEP對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，并初步探討了SEP抑制心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制可能與PPAR-α有關(guān)。但除PPAR-α信號(hào)途徑外，是否仍有其它信號(hào)通路直接參與或與PPAR-α信號(hào)通路交互作用影響心肌細(xì)胞肥大過(guò)程?仍有待于我們進(jìn)一步的研究。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將采用基因表達(dá)豐度分析和Western blot技術(shù)等手段對(duì)SEP對(duì)肥大心肌細(xì)胞抑制作用的具體機(jī)制進(jìn)行深入探索。

(致謝:本研究由商丘師范學(xué)院生物技術(shù)制藥實(shí)驗(yàn)室完成，部分研究工作得到山東大學(xué)劉純慧教授和遼寧醫(yī)學(xué)院王洪新教授的指導(dǎo)，特表示感謝! )

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Polysaccharide from eggs of S.nudus (SEP) prevents cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and high insulin in vitro in neonatal rat

ZHOU Qing-feng1，LIU Chun-hui2，WANG Hong-xin3
(1.Key Laboratory of Biotechnology Drug，Shangqiu Normal College，Shangqiu Henan 476000，China; 2.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250100，China; 3.Dept of Pharmacology，Liaoning Medical College，Jinzhou Liaoning 121001，China)

Abstract:AimTo study the protective effects of SEP on the hypertrophic myocardial cells induced with high glucose and high insulin and the mechanism.Methods

The protein content was assayed with Lowrys method; the cardiomyocytes area was measured by computer photograph analysis system; the expression of ANF and PPAR-α was determined by RT-PCR; APS was selected as control drug.ResultsCompared with conctrol group，the protein content，cardiomyocytes area and the expression of ANF and PPAR-α of high glucose and high insulin group were significantly increased.Compared with conctrol group，the SEP of different dosages were able to decrease the protein content，area，the expression of ANF mRNA and PPAR-α mRNA of cultured hypertrophic myocadial cells induced with high glucose and high insulin.ConclusionSEP can prevent cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and high insulin，which is related to its inhibition on PPAR-α signaling path.

Key words:myocardial cell; hypertrophy; neonatal rat; high glucose and high insulin; polysaccharide; SEP

作者簡(jiǎn)介:周慶峰(1977－)，男，博士，副教授，研究方向:糖尿病生化藥物，E-mail: zhouqingfeng715@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30901877) ;河南省教育廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No 13B310196)

收稿日期:2015－01－07，修回日期:2015－03－30

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0844－04中國(guó)圖書分類號(hào): R-332; R282.74; R322.11; R542.2; R587.2

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.021