mmLDL對小鼠腸系膜動脈α1受體介導的血管收縮及相關蛋白表達影響的研究

郭立軍，江高峰，李海鵬，李　瓊，劉恩岐，李　潔，

(1.南華大學附屬郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州　423000;2.南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽　421001; 3.湘南學院，湖南郴州　423000;4.西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，陜西西安　710061)

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mmLDL對小鼠腸系膜動脈α1受體介導的血管收縮及相關蛋白表達影響的研究

郭立軍1，3，江高峰2，李海鵬1，李瓊1，劉恩岐4，李潔1，2

(1.南華大學附屬郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000;2.南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽421001; 3.湘南學院，湖南郴州423000;4.西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，陜西西安710061)

摘要:目的探討mmLDL對小鼠腸系膜動脈α1受體的作用。方法小鼠尾靜脈注射mmLDL，微血管肌張力描記儀觀察NA引起的小鼠腸系膜動脈收縮量效曲線變化，RTPCR、Western blot檢測α1受體及α2受體表達。結(jié)果mmLDL引起NA收縮量效曲線明顯增強，表現(xiàn)為E(max)值由生理鹽水(NS)組的(120.75±3.44) %上升為(161.00± 6.87) % (P＜0.01)，pEC(50)值由NS組的(5.65±0.05)上升為(6.20±0.08) (P＜0.01)。α1受體拮抗劑哌唑嗪引起量效曲線的明顯右移，mmLDL引起α1受體mRNA水平、蛋白表達明顯增加，對α2受體表達基本沒有影響。結(jié)論尾靜脈注射mmLDL上調(diào)小鼠腸系膜動脈α1受體。

關鍵詞:mmLDL;腸系膜動脈;α1受體;哌唑嗪;育亨賓;尾靜脈注射

弱氧化低密度脂蛋白(minimally modified low density lipoprotein，mmLDL)是氧化程度輕微的LDL，脂質(zhì)部分被氧化，載脂蛋白B結(jié)構(gòu)完整，可以損傷內(nèi)皮細胞，增強單核細胞與內(nèi)皮細胞黏附，促進ox-LDL產(chǎn)生。mmLDL是動脈粥樣硬化(atherosderosis，AS)的危險因子，AS是心腦血管病的重要病理基礎，mmLDL引起AS的致病機制尚未研究清楚。AS是一種多因素共同參與的慢性炎癥性疾病，內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞遷移增殖在AS的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。心腦血管疾病與血管收縮功能異常息息有關，交感神經(jīng)系統(tǒng)對血管的活動有重要的調(diào)節(jié)作用。交感神經(jīng)興奮釋放去甲腎上腺素，主要通過興奮血管平滑肌α1受體，引起血管收縮。受體是傳遞生物信息、介導生物效應關鍵因素。受體本身會因新陳代謝而動態(tài)變化，其數(shù)量、親和力和效應會受生理、病理因素的影響而增多或減少。受體的調(diào)節(jié)是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。有文獻報道［1－2］，在高血壓大鼠和高血壓患者血管平滑肌α腎上腺素受體的反應性增強。研究mmLDL對在體腸系膜動脈α受體的作用，對闡明mmLDL致病機制有重要意義。

1　材料與方法

1.1主要試劑LDL，去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、普萘洛爾(propranolol，Prop)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、哌唑嗪(prazosin)及育亨賓(yohimbine)均購于Sigma公司，試劑用超純化水溶解，均用Krebs稀釋，濃度以浴槽中最終藥物的濃度表示。

α1受體抗體(Proteintech Biotechnology，Inc of USA)、α2受體抗體(American Research Products，Inc.)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(Pierce Biotechnology，Inc of USA)，GAPDH單克隆抗體(Proteintech Biotechnology，Inc of USA)。新鮮動物組、S 織Y?和B R 細 G 胞re 總en RNA抽提(試 Sh 劑an 盒gh 、a 通i N 用ov 逆lan 轉(zhuǎn)d錄工具包試劑盒Co.，Ltd.)。

1.2儀器DMT 620M微小血管張力測定儀(Danish Myo Technology A/S，DMT，丹麥)、Powerlab生物信號采集分析系統(tǒng)(AD instruments Co，Australia)、Zeiss-2000系列生物顯微鏡(德國蔡司光電儀器有限公司)、顯微手術解剖工具(World Precision Instruments，WPI，美國)，電子天平(BP211D，Startorius公司)、微量移液器(Dragonmed，芬蘭)、HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，LG冰箱、優(yōu)普純水機(成都優(yōu)普純水設備有限公司)，SWCJ-2FD-超凈無菌工作臺(蘇州安泰空氣技術公司)，美國Bio-RAD電泳儀，MX3000P實時熒光定量PCR儀(Stratagene，U.S.)，Image Gauge Ver.4.0 (Fuji Photo Film Co.，Ltd，日本)。

1.3實驗動物與分組8～11周齡SPF級的ICR小鼠，體質(zhì)量20～24 g，♀♂各半，從西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心購買，動物使用許可證編號: SYXK (陜) 2012－005。

實驗組尾靜脈注射mmLDL 1 mg·kg－1，第1次注射開始計時，每隔12 h重復1次，在處死動物的時間點不給藥(比如24 h組給藥時間為0、12 h)，分別于24、48、72、96、120 h將小鼠頸部脫臼處死，濃度累加法加入NA，觀察mmLDL對血管α受體介導的收縮功能的影響?？疾靘mLDL對血管α受體作用的量效關系時，設立mmLDL (0.5、1及1.5 mg· kg－1)組。實驗設對照組，分別為尾靜脈注射生理鹽水(normal saline，NS)組和LDL組［3］。

1.4血管收縮功能檢測小鼠脫臼處死，立即取出包含有腸系膜的組織，浸入預冷的Na+-Krebs液(含mmol·L－1: NaHCO315、NaCl 119、MgCl21.2、NaH2PO41.2、無水CaCl21.5、KCl 4.6和葡萄糖5.5)中，顯微鏡下剝離血管周圍組織，0.1% Triton X-100血管內(nèi)灌注10 s，去除血管內(nèi)皮，再用緩沖液沖洗10 s，20 μmol·L－1的5-HT預收縮，當乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)引起的舒張率＜10%，認為內(nèi)皮已被去除。將處理好的血管切成1～2 mm長的血管環(huán)，在顯微鏡下穿入兩根直徑為40 μm大小的金屬絲上，一根連接在可調(diào)負荷張力的微調(diào)裝置上，另一根連接張力換能器，張力換能器與Power-Lab系統(tǒng)相連，詳細記錄血管環(huán)的收縮曲線。將血管環(huán)放置于充滿Na+-Krebs液的37℃恒溫浴槽中，為使氧飽和，持續(xù)通入含(95% O2+ 5% CO2)的混合氣體，pH保持在7.4左右［4－6］。保持靜息張力為1.5 mN，每隔20 min更換1次Krebs液，平衡1.5 h。加K+-Krebs液(含mmol·L－1: NaHCO315、NaH2PO41.2、CaCl21.5、KCl 63.5、MgCl21.2、NaCl 60、和葡萄糖5.5)以檢測血管環(huán)的活性，Na+-Krebs液沖洗血管環(huán)3次，重復上述步驟。兩次K+－Krebs液引起的收縮幅度均大于1 mN并且兩次收縮幅度差在10%以內(nèi)，才可進行后續(xù)實驗。用Prop (10－9mol·L－1)于浴槽中孵育血管0.5 h阻斷β受體，再濃度累加法加入NA(10－11～10－4mol· L－1)，考察α受體功能。先分別用Prop與不同濃度α1受體拮抗劑哌唑嗪(10－11～10－9mol·L－1)或不同濃度α2受體拮抗劑育亨賓(10－7～10－5mol· L－1)孵育血管0.5 h，再濃度累加法加入NA，分別考察α1和α2受體在NA引起的收縮量效曲線的作用。

1.5RT-PCR總的RNA提取使用RNA抽提試劑盒，按照使用說明書提取。檢測260 nm、280 nm吸光度，考察總RNA濃度和純度。按說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR在MX3000P實時熒光定量PCR儀中進行，使用基因擴增的SYBR Green試劑盒，以cDNA為模版。設立對照組，除不加cDNA外，余平行操作。引物根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫應用引物表達-2軟件設計，α1受體前引物: 5'-ATCCTCTCGGTGGCCTGTCATC -3';后引物:5'-AGATGGCAGAGAAGGGCA GCAC-3' (115 bp)。α2受體前引物: 5'- AGGTGACACTGACGCTGGTTTG -3';后引物: 5'- AAGAGGTTTTGGGGAGCTTTGAG-3' (121 bp)。管家基因β-actin mRNA，在細胞內(nèi)連續(xù)恒定表達，作為mRNA定量的參照。β-actin前引物: 5'- AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC -3';后引物: 5'- GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3' (119 bp)。反應體系為25 μL，開始在95℃反應3 min，94℃反應12 s，62℃反應40 s，完成40個PCR循環(huán)。反應結(jié)束后采用分離曲線分析法以確定PCR反應產(chǎn)物的特異性。mRNA定量分析采用PCR循環(huán)閾值(CT)比較法，以β-actin的CT值為內(nèi)對照，計算α1受體、α2受體mRNA相對表達量。

1.6Western blot由于1只小鼠腸系膜動脈提取的蛋白不足以開展Werstern blot研究，因此，每個樣本由3根小鼠腸系膜動脈組成，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞提取變性緩沖液RIPA裂解液，勻漿。使用BCA蛋白分析試劑盒蛋白定量。提取的蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳進行分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶(T-TBS緩沖液配置)封閉。一抗α1受體抗體(1∶1 000稀釋)，α2受體抗體(1∶1 000稀釋)和GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)，稀釋液為含2%牛血清白蛋白的PBS;二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋)。圖像經(jīng)Image Gauge Ver.4.0 (Fuji Photo Film Co.，Ltd，日本)，對光密度進行分析，并且均采用自身灰度值校正，以目的基因的條帶灰度與管家基因的灰度比值表示蛋白的表達水平。

2　結(jié)果

2.1mmLDL的制備將LDL(0.2 g·L－1)置于不含EDTA，含1 μmol·L－1FeSO4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，在4℃透析96 h，再用0.25 mmol·L－1EDTA終止氧化反應，生成mmLDL［8－11］。將mmLDL濃縮成1 g·L－1。mmLDL的氧化程度采用硫代巴比妥酸反應物質(zhì)法(thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS)進行檢測，結(jié)果顯示，丙二醛樣結(jié)構(gòu)濃度為(10.47± 1.13)μmol·g－1LDL(mmLDL的TBARS檢測值為5－20 μmol·g－1LDL)。同時0.8%瓊脂糖膠電泳結(jié)果顯示，mmLDL的電泳遷移率是LDL的1.69倍(倍數(shù)值為1.50－2.00時為合格)。制備好的mmLDL存放于4℃，避光，兩周內(nèi)用完。

2.2血管環(huán)對K+的收縮反應、動脈內(nèi)皮去除及血清oxLDL水平測定使用mmLDL尾靜脈注射，血管環(huán)對63.5 mmol·L－1K+的收縮值在各組間的差異沒有統(tǒng)計學意義［如: NS組(2.58±0.47) mN，mmLDL組(2.87±0.49) mN，n=8，P＞0.05］。用20 μmol·L－1的5-HT預收縮血管環(huán)，再用10 mmol ·L－1ACh舒張，舒張率低于預收縮值的5%，表明內(nèi)皮去除完全。我們對血清中oxLDL的濃度水平進行了測定，結(jié)果表明，mmLDL組血清中oxLDL濃度水平較生理鹽水組略有升高，但差異無顯著性［mmLDL組(317±39)μg·L－1，NS組(276±31) μg·L－1，n=8，P＞0.05］。

2.3mmLDL影響α受體介導收縮反應的時效和量效關系考察mmLDL影響腸系膜動脈α受體介導收縮反應的時間－效應關系，實驗組按1 mg· kg－1的劑量尾靜脈注射mmLDL。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著時間的延長，mmLDL提高α受體介導收縮反應的作用逐漸增強，表明mmLDL提高血管α受體收縮反應的作用呈時間依賴性。在24 h及48 h，α受體介導收縮量效曲線變化不明顯; 72 h時，α受體收縮效應出現(xiàn)上升，但與NS組比差異無統(tǒng)計學意義; 96h時，α受體介導的收縮曲線明顯上升伴隨明顯左移;120 h時，α受體收縮量效曲線與96 h比較略有升高(Fig 1A)。考察mmLDL (劑量分別為0.5、1及1.5 mg·kg－1) 96 h后對腸系膜動脈α受體收縮量效曲線的劑量－效應關系，結(jié)果顯示，實驗組中尾靜脈注射mmLDL對α受體收縮作用的影響隨著劑量增大而加強，表明mmLDL對血管α受體收縮作用的影響呈劑量依賴性。與對照組相比，0.5 mg·kg－1劑量組α受體介導的收縮量效曲線出現(xiàn)了升高(P＞0.05) ; 1 mg·kg－1劑量組出現(xiàn)明顯上升;1.5 mg·kg－1劑量組較1 mg·kg－1略有上升，差異無統(tǒng)計學意義(Fig 1B)。故選擇劑量為1 mg· kg－1、時間點為96 h來考察mmLDL對小鼠腸系膜動脈α受體收縮反應的影響，實驗結(jié)果Emax值由NS組的(120.75±3.44) %上升為mmLDL組的(161.00±6.87) % (P＜0.01)，pEC50值由NS組的(5.65±0.05)上升為mmLDL組的(6.20±0.08) (P＜0.01)，表明量效曲線出現(xiàn)了明顯增高伴明顯左移。實驗結(jié)果還顯示尾靜脈注射1 mg·kg－1LDL，96 h時α受體介導的收縮量效曲線與NS組比基本上沒有改變。

Fig 1 Effects of mmLDL on concentration-contractile curves induced by noradrenalin in a time-dependent(A) and

考察α受體亞型，使用選擇性α1受體拮抗劑哌唑嗪(10－11～10－9mol·L－1)使NA量效曲線平行右移，pA2值在mmLDL組和NS組分別為10.54 ±0.77和9.85±0.64(Fig 2)。選擇性α2受體拮抗劑育亨賓(10－7～10－5mol·L－1)使NA量效曲線平行右移，pA2值在mmLDL組和NS組分別為7.51±0.40和7.13±0.76(Fig 3)。

Fig 2 Concentration-contraction curves of mmLDL (A) and NS (B) in mouse mesenteric arteries induced by noradrenalin (±s，n=8)

2.4mmLDL增加α1受體表達，不影響α2受體表達mmLDL引起α1受體表達增加。尾靜脈注射mmLDL后，α1受體mRNA水平相對于NS組升高為(603±38) % (P＜0.01) ;α1受體蛋白水平由NS組的0.90±0.02升高為1.31±0.03 (P＜0.01) (Fig 4)。

尾靜脈注射mmLDL后，α2受體表達幾乎沒有變化。α2受體mRNA水平由NS組略降低為(89± 3) % (P＞0.05) ;α2受體蛋白水平由NS組的0.76 ±0.04略升高為0.78±0.02 (P＞0.05) (Fig 5)。

Fig 3 Concentration-contraction curves of mmLDL (A) and NS (B) in mouse mesenteric arteries induced by noradrenalin (±s，n=8)

3　討論

mmLDL是AS等心腦血管疾病的危險因子，AS是一種慢性炎癥性疾病，早期表現(xiàn)為內(nèi)皮損傷，血管平滑肌遷移增殖。近期課題組研究發(fā)現(xiàn)，mmLDL可以上調(diào)離體大鼠冠狀動脈和腦基底動脈內(nèi)皮素B (endothelin B，ETB)受體，血管收縮性增強［12－13］;尾靜脈注射mmLDL能損傷血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)，損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張［3］。我們的研究結(jié)果顯示，mmLDL損傷血管內(nèi)皮細胞，此作用是AS的誘發(fā)因素; mmLDL上調(diào)血管平滑肌細胞ETB受體，增加了血管張力，表明mmLDL對血管平滑肌有影響。本研究結(jié)果進一步證實尾靜脈注射mmLDL可以上調(diào)在體小鼠腸系膜動脈的α1受體，我們首次從整體動物實驗證實了mmLDL可以對血管平滑肌受體產(chǎn)生作用。

心腦血管疾病的發(fā)生常常與血管的收縮、舒張功能失調(diào)有關。交感神經(jīng)興奮，末梢釋放NA，NA激動血管平滑肌細胞膜上的α1受體，強烈收縮血管。血管平滑肌的收縮功能是影響血管阻力的重要因素，危險因子與機體相互作用，改變平滑肌的收縮功能，這種變化可能與疾病互為因果，成為疾病的基礎。本研究觀察mmLDL對在體血管平滑肌的影響，實驗過程中去除血管內(nèi)皮，因為血管內(nèi)皮可以釋放NO、ET-1等影響血管張力的血管活性物質(zhì)，干擾血管環(huán)張力測定。使用β受體拮抗劑普萘洛爾孵育血管環(huán)，再濃度累加法加入NA，消除β受體對收縮曲線的干擾。預實驗中我們測定血清中oxLDL的濃度水平顯示，mmLDL組血清中oxLDL濃度水平較生理鹽水組略有升高，但差異無顯著性，表明血管平滑肌收縮功能增強與oxLDL無關。在實驗中發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射mmLDL可以時間依賴性和劑量依賴性的增加α受體收縮反應性。給予劑量為1 mg· kg－1mmLDL，72 h內(nèi)α受體收縮反應性逐漸增強，但是與生理鹽水組比差異無顯著性，96 h后可以引起的NA收縮功能較生理鹽水組明顯增強，量效曲線明顯左移，表明mmLDL增強NA引起血管的收縮功能?？疾歃?受體、α2受體在NA引起收縮反應的作用時，分別在mmLDL組和生理鹽水組加入α1受體拮抗劑哌唑嗪和α2受體拮抗劑育亨賓。在mmLDL組和生理鹽水組，α1受體拮抗劑哌唑嗪的pA2值分別為10.54±0.77和9.85±0.64，α2受體拮抗劑育亨賓的pA2值分別為7.51±0.40和7.13 ? ±0.76，與早期的文獻報道一致［14］。mmLDL組我們觀察到α1受體拮抗劑哌唑嗪在濃度為10－11? mol ·L－1時引起量效曲線?的明顯右移，而α2受體拮抗劑育亨賓產(chǎn)生類似作用需要的濃度為10－6mol· L－1，是哌唑嗪濃度的100 000倍，表明mmLDL引起的NA收縮反應增強主要是由α1受體介導，這與文獻報道高血壓患者與α1受體表達上調(diào)有關相一致［15］。在RT-PCR和Western blot的實驗結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)mmLDL能明顯增加的α1受體mRNA水平和蛋白表達，對α2受體的蛋白表達沒有明顯影響，這與功能實驗結(jié)果一致。mmLDL引起α2受體mRNA水平略為降低，可能是由于mmLDL明顯升高α1受體表達的一種反饋調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示mmLDL引起NA收縮量效曲線增強并伴隨明顯左移主要是由于增加了α1受體在血管平滑肌的表達，增加了α1受體介導的收縮功能。

Fig 4 Effect of mmLDL on expressions of α1adrenoceptor in mouse mesenteric arteries(±s)

Fig 5 Effect of mmLDL on expressions of α2adrenoceptor in mouse mesenteric arteries(±s)

(致謝:本研究功能學實驗部分在西安交通大學醫(yī)學院賀浪沖教授實驗室完成，在此特別感謝。)

綜上所述，尾靜脈注射mmLDL對腸系膜動脈平滑肌有作用，增加了動脈α1受體的mRNA水平、蛋白表達，并且增加小鼠腸系膜動脈α受體的收縮反應主要由α1受體介導。mmLDL可以通過上調(diào)α1受體增加血管平滑肌的收縮功能，此作用是否參與了血管平滑肌細胞遷移到內(nèi)皮下還需要進一步研究。

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Study of α1adrenoceptor-mediated vasoconstriction and protein expressions induced by mmLDL in mouse mesenteric artery

GUO Li-jun1，3，JIANG Gao-feng2，LI Hai-peng1，LI Qiong1，LIU En-qi4，LI Jie1，2
(1.The First People’s Hospital of Chenzhou，University of South China，Chenzhou，Hunan 423000，China; 2.Institute of Drug and Pharmacology，University of South China，Hengyang Hunan 421001，China; 3.Xiangnan University，Chenzhou Hunan 423000，China;4.Xi’an Jiaotong University，Medical College，Xi’an 710061，China)

Abstract:AimTo investigate the effects of mmLDL on the up-regulation of α1receptors in moues mesenteric arteries.Methods Mice tail intravenous injection of mmLDLwasused.Vitrosensitivemyographwasempl-book=833,ebook=98oyed to examine Noradrenaline (NA) induced vascular contraction on mice mesenteric artery，and the mRNA and protein expressions of α1and α2receptors were analyzed by real-time PCR and Western blot，respectively.ResultsmmLDL significantly increased NA induced concentration-contractile curve，and the data of E(max)and pEC(50)were from (122.61±9.40) %and (5.65±0.05) in normal saline (NS) group to (161.01±6.90) % and (6.20±0.08) in mmLDL group (P＜0.01，P＜0.01)，respectively.The α1adrenoceptor antagonist prazosin shifted the concentration-contractile curve induced by NA towards right.After using mmLDL，the mRNA and protein levels of α1adrenoceptor were significantly increased，but the mRNA and protein levels of α2adrenoceptor were not changed.ConclusionTail intravenous injection of mmLDL enhanc? es the vascular expressions of α1adrenoceptors and the contractile effects mediated by α1adrenoceptors.

Key words:mmLDL; mesenteric artery;α1adrenoceptor; prazosin; yohimbine; tail intravenous injection

作者簡介:郭立軍(1979－)，男，碩士，講師，主治醫(yī)師，研究方向:血管病理學，E-mail: guolijun54@126.com;李潔(1974－)，女，博士，主任藥師，研究方向:血管藥理學，通訊作者，E-mail: lijieemail2005@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81202535) ;郴州市科技局資助項目(No CZ2014015)

收稿日期:2015－02－01，修回日期:2015－03－20

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0827－07中國圖書分類號: R-332; R322.121; R392.11; R977.6

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.018