胃轉流手術對糖尿病大鼠肝臟糖代謝相關因子表達的影響

李旭忠，顏 勇，周 舟，邱文娟，周聯(lián)明，黃忠明，胡 承，張學利*

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胃轉流手術對糖尿病大鼠肝臟糖代謝相關因子表達的影響

李旭忠1，顏 勇2，周 舟3，邱文娟1，周聯(lián)明2，黃忠明2，胡 承3，張學利2*

（1蘇州大學研究生院，蘇州 215000；2上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院普外科，上海 201400；3上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海 200233）

通過建立2型糖尿?。═2DM）胃轉流手術（GBP）大鼠模型，探討對肝臟糖代謝相關因子表達的影響。將12只SD大鼠隨機分為正常對照組（NCD，＝4）、高脂組（HFD，＝4），高脂手術組（HFD-GBP，＝4）；HFD組大鼠經高脂飼料喂養(yǎng)4周后，通過腹腔注射鏈脲佐菌素構建T2DM模型，比較兩組體質量、血糖、口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）、胰島素耐量實驗（ITT）的變化。2周后，構建HFD-GBP組胃轉流手術模型，連續(xù)觀察2周，比較手術前后兩組體質量、血糖濃度的變化，并分別提取3組大鼠肝組織的總RNA和蛋白，通過RT-PCR、Western印跡法檢測法呢醇X受體（FXR）、磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶（PEPCK）、葡萄糖?6?磷酸酶（G6Pase）、葡萄糖轉運體2（GLUT2）和成纖維細胞生長因子-21（FGF-21）的表達水平。與HFD組相比，HFD-GBP組大鼠體質量下降，血糖改善（＜0.05），術后FXR和GLUT2 mRNA表達明顯上調（＜0.05），PEPCK、G6Pase和FGF-21 mRNA表達也增加；與NCD組相比，HFD和HFD-GBP兩組FXR和PEPCK蛋白表達明顯升高（＜0.05）。在T2DM大鼠模型中，GBP能有效改善糖代謝；FXR、PEPCK和GLUT2可能參與GBP術后的血糖調節(jié)過程。

胃轉流術；糖尿病，2型；法呢醇X受體；磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶

減重手術包括胃轉流術（gastric bypass，GBP）、袖狀胃切除術、膽胰轉流術、回腸轉位術等手術方式。目前GBP和袖狀胃切除術在臨床上應用相對較多[1]。近年來對接受減重手術的患者研究發(fā)現，對伴2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的肥胖患者行GBP術后，在減重的同時，能在一定時間內緩解糖尿病，并能減少并發(fā)癥的發(fā)生[2?4]?；跍p重手術對T2DM的療效，國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）正式發(fā)表聲明，認為以GBP為代表的減重手術可用于治療T2DM。本研究擬通過建立T2DM GBP模型，並檢測術后體質量、血糖和糖代謝相關因子的變化，進一步明確GBP術對糖代謝的影響，更為明確手術治療糖尿病的機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1　實驗器材和試劑

磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶（phosphoenolpyr-uvate carboxykinase，PEPCK）單克隆抗體（sc-32879）（Santa Cruz公司），法呢醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）抗體（ab126602）（ABACAM公司）。中國三諾微量血糖儀及血糖試紙；Real-time PCR擴增儀（美國ABI7500公司）；酶標儀（美國Beckman公司）。高脂飼料（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。

1.2 實驗動物和方法

普通級6周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠（上海西普爾?必凱實驗動物有限公司）。SD大鼠12只，隨機分為正常對照組（normal chow diet，NCD）4只、高脂組（high-fat diet，HFD）4只、高脂手術組（high-fat diet followed by GBP，HFD-GBP）4只。HFD組高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）35mg/kg，構建T2DM模型。2周后構建T2DM GBP模型。

1.3 手術方法

術前禁食16h，不禁水。1%戊巴比妥鈉0.5ml/100g左或右腹腔注射麻醉，麻醉成功后，腹部備皮，將大鼠固定于手術臺上，術野常規(guī)碘伏消毒后，鋪無菌洞巾。取上腹正中切口，上至劍突，下至臍部，依次切開皮膚、皮下組織，鈍性分離肌肉，打開腹膜。分離并以4?0絲線結扎胃周韌帶與血管，于胃小彎處距食管胃交界處3～5mm向大彎側斜行斷胃，斷端以5?0絲線連續(xù)縫合關閉，并以4?0絲線間斷縫合加強，曠置遠端胃大部，保證留下的胃小囊約占胃總容積的20%。曠置十二指腸+近端1/5空腸，即距離屈氏韌帶10cm處離斷空腸，空腸遠端與殘胃行側端吻合，近端與胃腸吻合口以遠15cm處行端側吻合。各組關腹前用生理鹽水擦拭腹腔，檢查有無活動性出血。以3?0絲線關閉腹膜及腹肌，4?0絲線間斷縫合皮膚。

1.4 檢測項目和方法

術前每周禁食12h后，測定NCD組和HFD組大鼠體質量和血糖，高脂喂養(yǎng)4周后注射STZ（35mg/kg），每隔3d檢測血糖變化，術前1周行口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）、胰島素耐量實驗（insulin tolerance test，ITT）。手術當天測定各組空腹狀態(tài)下大鼠體質量和血糖。術后觀察2周，每周測定各組大鼠體質量和血糖。2周后，提取各組大鼠肝組織備用。通過逆轉錄?聚合酶鏈反應（reverse transcription- polymerase chain reaction，RT-PCR）和Western印跡法檢測各組大鼠肝中FXR、PEPCK、葡萄糖?6?磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）、葡萄糖轉運蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）和成纖維細胞生長因子?21（fibroblast growth factor-21，FGF-21）相對表達情況。

1.5　實時熒光定量法（RT-PCR）

在NCBI（National Center for Biotechnology Information）中查找目的基因的信使RNA（messenger ribonucleic acid，mRNA），應用Primer Premier5.0設計引物，NCBI-blast驗證PCR引物。FXR引物為5￠-GCCTCTGCTCGATGTCCTACA-3'和5￠-GGAGGCAGGCGAAATGCT-3'；FGF-21引物為5￠-ACCGGAGTCAGAACACAATTCC-3'和5￠-AACTCTAGATCTCATCCATTCCATCA-3￠；G6Pase引物為5￠-CCCAGACTAGAGATCCTGACAGAAT-3￠和引物5￠-GCACAACGCTCTTTTCTTTTACC-3￠；GLUT2引物為5￠-TGACCGAAGAGCTACCATTAACTATG-3￠和5￠-GTGTCGTATGTGCTGGTGTGACTSYBR-3￠；PEPCK引物為5￠-GCCTGTGGGAAAACCAACCT-3'和5￠-CACCCACACATTCAACTTTCCA-3￠；引物均由上海BioTNT公司合成。Premix EX Taq（TaKaRa公司），Light Cycler 480實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche公司）。PCR反應預變性95℃ 5min，變性95℃ 5s，退火60℃30s，反應40個循環(huán)。每個基因重復操作3次，運用2?△△Ct法分析結果。

1.6　Western印跡法

進行配膠、蛋白變性及上樣、蛋白電泳、轉膜及封閉操作后，FXR一抗（1∶2000）、PEPCK一抗（1∶500），4℃孵育過夜后室溫孵育1h，洗膜后二抗（1∶2500）室溫孵育2h后洗膜，按ECL試劑盒（Pierce公司）說明書操作顯影后運用分析軟件Gel-Pro analyzer 4分析條帶灰度值計算蛋白相對表達量。

1.7　統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 構建T2DM大鼠模型

HFD組高脂喂養(yǎng)大鼠4周，各組大鼠體質量、血糖均無統(tǒng)計學差異（圖1A，1B；＞0.05）。HFD組腹腔注射STZ后，HFD組血糖明顯升高，糖耐量和胰島素敏感性明顯降低（圖1C，1D；＜0.05）。

2.2 手術前后大鼠體質量和血糖的變化

與術前（0周）相比，HFD-GBP組術后1周體質量及空腹血糖顯著降低（＜0.05），NCD和HFD組同時間點體質量和血糖與0周比較差異無統(tǒng)計學意義（表1，表2；＞0.05）。

2.3 3組大鼠肝組織中FXR的表達變化

3組大鼠肝FXR mRNA相對表達量：NCD組為3325.0±589.8，HFD組5093.0±532.8，HFD-GBP組8835.0±165.6。FXR蛋白相對表達量：3組分別為1.201±0.634，6.230±3.265，3.723±0.808。FXR mRNA表達，NCD組與HFD組差異無統(tǒng)計學意義（＝2.015，＞0.05），NCD和HFD-GBP組差異有統(tǒng)計學意義（＝8.994，＜0.01）；HFD和HFD-GBP組差異有統(tǒng)計學意義（＝4.645；＜0.05；圖2A）。FXR蛋白相對表達NCD組與HFD組、HFD-GBP組差異均有統(tǒng)計學意義（＝1.834，＜0.05；＝3.473，＜0.05）；HFD組和HFD-GBP組差異無統(tǒng)計學意義（＝0.912，＞0.05；圖2B）。

2.4 3組大鼠肝組織中PEPCK的表達變化

3組大鼠肝PEPCK mRNA相對表達量：NCD組為47460±3643，HFD組為49850±1480，HFD-GBP組為68940±2667。PEPCK蛋白相對表達量：3組分別為1.538±1.907，為3.694±2.470，3.284±0.749。PEPCK mRNA表達，NCD組與HFD組差異無統(tǒng)計學意義（＝2.015，＞0.05），NCD和HFD-GBP組差異有統(tǒng)計學意義（＝4.475，＜0.05）；HFD和HFD-GBP組差異無統(tǒng)計學意義（＝0.693；＞0.05；圖3A）。PEPCK蛋白相對表達，NCD組與HFD組、HFD-GBP組差異均有統(tǒng)計學意義（＝1.063，＜0.05；＝1.204，＜0.05）；HFD組和HFD-GBP組差異無統(tǒng)計學意義（＝0.218，＞0.05；圖3B）。

表1 手術前后大鼠體質量比較

NCD: normal chow diet; HFD: high-fat diet; HFD-GBP: high-fat diet followed by gastric bypass. Compared with pre-operation (0-week) in the same group,*＜0.05

表2 手術前后大鼠空腹血糖比較

NCD: normal chow diet; HFD: high-fat diet; HFD-GBP: high-fat diet followed by gastric bypass. Compared with pre-operation (0-week) in the same group,*＜0.05

2.5 3組大鼠肝臟組織中G6Pase，GLUT2及FGF-21 mRNA的表達變化

3組大鼠肝G6Pase mRNA相對表達量：NCD組為28 430±2599，HFD組10 400±739，HFD-GBP組為14610±3207。FGF-21 mRNA相對表達量：3組分別為337.4±24.1，172.9±78.6，254.3±6.1。GLUT2 mRNA相對表達量：分別為1041±59，864±52，3931±189。G6Pase和FGF-21 mRNA各組間差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05；圖4A，4B）。GLUT2 mRNA表達，NCD組與HFD組無統(tǒng)計學差異（＞0.05），但和HFD-GBP組相比較差異均有統(tǒng)計學意義（＝3.463，＜0.05；＝4.185，＜0.05；圖4C）。

3 討 論

減重手術用于治療T2DM已逐漸被醫(yī)學界所熟知，尤其對肥胖合并T2DM的患者效果更顯著，術后在體質量下降的同時，血糖也得到了明顯改善。Mingrone等[5]在隨機對照研究中，將60例伴有T2DM的病態(tài)肥胖患者隨機分為內科治療組、GBP組及膽胰轉流術組，研究術后T2DM緩解率，結果2年時內科治療組緩解率為0%，GBP組及膽胰轉流術組緩解率分別為75%和95%。Schauer等[6,7]分析隨機對照研究150例伴有T2DM的肥胖患者，接受單獨內科治療、內科治療+GBP及內科治療+袖狀胃切除術后1年和3年的血糖控制情況，發(fā)現減肥手術+內科治療明顯優(yōu)于單獨內科治療?？梢?，一定時間內減肥手術可以治療T2DM。雖然減重手術在治療糖尿病中療效顯著，但是，減重手術治療糖尿病的作用機制仍未揭曉。手術前后胃腸道激素、膽汁酸代謝、腸道菌群的變化，是目前研究的熱點。Pournaras等[8]在人體和動物研究中得出GBP術后血清膽汁酸水平升高，可刺激腸道高血糖素樣肽?1、多肽YY等激素分泌，進而達到改善T2DM的效果。Ryan等[9]在袖狀胃切除術肥胖小鼠模型中發(fā)現，術后小鼠體質量下降的同時，循環(huán)中膽汁酸水平增加，腸道微生物菌群也發(fā)生了顯著變化。Turnbaugh等[10,11]則將肥胖小鼠的腸道微生物移植到無菌小鼠中，無菌小鼠體質量增加。而從GBP術后小鼠中移植的微生物卻減慢了體質量的增加[12]?？梢?，減重手術可通過影響胃腸道激素、膽汁酸代謝、腸道菌群變化等多方面的作用改善糖尿病。

圖1 T2DM大鼠模型的相關指標檢測

Figure 1 Assessment of T2DM rat model

T2DM: type 2 diabetes mellitus; NCD: normal chow diet; HFD: high-fat diet; OGTT: oral glucose tolerance test; ITT: insulin tolerance test .Compared with NCD,*＜0.05

圖2 3組大鼠肝組織中FXR表達

Figure 2 FXR expression in liver tissue in three groups

FXR: farnesoid X receptor; NCD: normal chow diet; HFD: high-fat diet; HFD-GBP: high-fat diet followed by gastric bypass.Compared with NCD,**＜0.01; compared with HFD,#＜0.05

圖3 3組大鼠肝組織中PEPCK表達

Figure 3 PEPCK expression in liver tissue in three groups

PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase; NCD: normal chow diet; HFD: high-fat diet; HFD-GBP: high-fat diet followed by gastric bypass. Compared with NCD,*＜0.05

圖4 3組大鼠肝組織中G6Pase、FGF-21和GLUT2 mRNA的表達

Figure 4 G6Pase, FGF-21 and GLUT2 mRNA expression in liver tissue in three groups

G6Pase: glucose-6-phosphatase; FGF-21: fibroblast growth factor-21; GLUT2: glucose transporter 2; NCD: normal chow diet; HFD: high-fat diet; HFD-GBP: high-fat diet followed by gastric bypass. Compared with NCD,HFD,*＜0.05

本實驗通過建立T2DM GBP模型觀察GBP對糖代謝的影響，發(fā)現GBP在減輕體質量和改善血糖水平的同時，肝中相關糖代謝因子也發(fā)生變化。FXR在肝、小腸等器官中高表達。生理情況下，膽汁酸可激活FXR，因此也被稱為膽汁酸受體。近年來研究發(fā)現膽汁酸?FXR信號通路可能在減重手術治療糖尿病中發(fā)揮重要作用[9]。本研究發(fā)現，GBP在早期改善糖尿病的同時，術后肝組織中FXR的表達水平顯著提高，說明FXR對糖代謝發(fā)揮重要作用。PEPCK是糖異生中的關鍵酶，主要在肝中表達。Ma等[13]發(fā)現膽汁酸通過FXR途徑抑制糖異生限速酶PEPCK的表達，而Stayrook等[14]研究發(fā)現FXR能通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α而上調PEPCK的表達。本研究初步探索發(fā)現，與非手術相比，GBP后在改善糖代謝的同時，肝中PEPCK的表達增加。因此，可推斷PEPCK也參與術后糖代謝穩(wěn)態(tài)。GLUT2是介導葡萄糖攝取的膜蛋白，是肝、胰島β細胞、小腸等器官或細胞最主要的葡萄糖轉運體。在新西蘭肥胖小鼠[15]以及Zuker肥胖糖尿病大鼠[16]等多種糖尿病動物模型中，胰島β細胞GLUT2的表達減少。在這些模型中胰島β細胞GLUT2的減少與葡萄糖刺激下胰島素分泌能力下降密切相關。我們目前發(fā)現GBP后的T2DM大鼠肝中GLUT2 mRNA表達上調。但GLUT2是如何參與術后糖代謝，還需進一步研究。實驗研究[17]發(fā)現T2DM患者行GBP術后血清中膽汁酸水平升高，血清中FGF-21也增加，由此推斷術后FGF-21對糖代謝發(fā)揮有利影響。

由于本實驗受樣本量少及研究時間短等因素限制，研究尚不深入?？傊?，GBP已成為一種有效的干預T2DM的手術方式，其作用機制值得我們去探究，期望在糖尿病的治療方式上有更新的突破。

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（編輯: 周宇紅）

Effect of gastric bypass on expression of glycometabolism-related factors in liver of type 2 diabetes mellitus rats

LI Xu-Zhong1, YAN Yong2, ZHOU Zhou3, QIU Wen-Juan1, ZHOU Lian-Ming2, HUANG Zhong-Ming2, HU Cheng3, ZHANG Xue-Li2*

(1Graduate School, Soochow University, Suzhou 215000, China;2Department of General Surgery, Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People’s Hospital South Campus, Shanghai 201400, China;3Department of Endocrinology and Metabolism, Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai Institute of Diabetes, Shanghai 200233, China)

To establish a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM) following by gastric bypass (GBP) surgery, and then determine the effect of GBP on the expression of glycometabolism-related factors in the liver.Twelve 6-week-old SD rats were randomly divided into normal chow diet group (NCD,＝4) and high-fat diet group (HFD,＝8). In 4 weeks after high-fat diet, the rats of the latter group were injected with streptozocin (STZ) intraperitoneally to induce T2DM model. Body mass and blood glucose were measured, oral glucose tolerance test (OGTT) and insulin tolerance test (ITT) were carried out in the NCD and HFD groups, and the results were compared between them. In 2 weeks later, 4 rats of the HFD group underwent GBP surgery and named as HFD-GBP group. After another 2 weeks, body mass and blood glucose were measured again. The expression of farnesoid X receptor (FXR), phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), glucose-6-phosphatase (G6Pase), glucose transporter 2 (GLUT-2) and fibroblast growth factor-21 (FGF-21) at mRNA and protein levels in the liver of the 3 groups of rats were detected by RT-PCR and Western blotting respectively.Compared with the HFD group, the HFD-GBP group had significantly decreased body mass and improved blood glucose (＜0.05), obviously up-regulated FXR and GLUT2 at mRNA level (＜0.05), and increased mRNA expression of PEPCK, G6Pase and FGF-21. The protein expression levels of FXR and PEPCK were significantly elevated in HFD and HFD-GBP groups than in the NCD group (＜0.05).GBP surgery effectively improves glucose metabolism in T2DM rats. FXR, PEPCK and GLUT2 may participate in the blood glucose regulation after the surgery.

gastric bypass; diabetes mellitus, type 2; farnesoid X receptor; phosphoenolpyruvate carboxykinase

R587.1

A

10.11915/j.issn.1671?5403.2015.01.017

2014?11?05;

2014?11?13

張學利, E-mail: lejing1996@aliyun.com