C反應蛋白單核苷酸多態(tài)性與睡眠呼吸暫停綜合征患者合并高血壓的關系

錢小順，劉 偉，孫 靜，李天志，郭瑞表，孫寶君

?

C反應蛋白單核苷酸多態(tài)性與睡眠呼吸暫停綜合征患者合并高血壓的關系

錢小順1，劉 偉2，孫 靜3，李天志1，郭瑞表1，孫寶君1

（解放軍總醫(yī)院南樓臨床部：呼吸內科1，保健科3，北京 100853；2解放軍第302醫(yī)院呼吸內科，北京 100039）

探討C反應蛋白（CRP）單核苷酸多態(tài)性與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAHS）合并高血壓的關系。2006年1月至2012年12月間于解放軍總醫(yī)院行多導睡眠檢查，結果為重度OSAHS的300例男性患者，其中OSAHS伴高血壓者145例，并隨機抽取100例健康男性對照，采用基因測序的方法，檢測CRP啟動區(qū)基因rs3091244和rs1205的基因多態(tài)性。采用R×C列聯(lián)表2檢驗統(tǒng)計OSAHS伴高血壓組、單純OSAHS組以及健康對照組之間CRP基因多態(tài)性的關系。OSAHS合并高血壓組rs3091244的CT型基因比例增高，為17%，而單純OSAHS組為7%。并且rs3091244的T等位基因頻率在OSAHS合并高血壓組中也明顯增高，為9%，而單純OSAHS組為3%。rs1205的CC基因型在OSAHS合并高血壓組中明顯升高，為25%，而單純OSAHS組為11%。CRP的單核苷酸多態(tài)性與OSAHS合并高血壓有關，rs3091244的CT型基因和rs1205的CC型基因可能通過增加血清CRP水平，引起體內慢性炎癥，從而在高血壓的發(fā)生中產生作用。

C反應蛋白質；睡眠呼吸暫停，阻塞性；高血壓；單核苷酸多態(tài)性

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是繼發(fā)性高血壓的首要原因[1]。慢性炎癥是OSAHS引起繼發(fā)性高血壓的重要因素[2]。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS引起慢性炎癥存在不均質性，相同程度的OSAHS引起慢性炎癥的程度并不相同，并且與OSAHS相關高血壓的發(fā)生密切相關，另外，炎癥因子的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在其中起重要作用[3]。C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是臨床上重要的炎癥因子，是眾多疾病炎癥程度的重要判斷指標。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)血清CRP水平與OSAHS相關高血壓的發(fā)生有關[4]。本研究主要觀察CRP的SNP與OSAHS合并高血壓的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2006年1月至2012年12月間于解放軍總醫(yī)院做OSAHS檢查的相關患者。按納入標準募集300例OSAHS患者，均為男性漢族，其中145例合并高血壓。本組OSAHS患者合并高血壓均在OSAHS發(fā)生后1～10（5.4±3.3）年出現(xiàn)。OSAHS的診斷參照2011年中華醫(yī)學會睡眠呼吸障礙組確定的標準[5]，均為重度患者。高血壓診斷標準參照2010年《中國高血壓防治指南》[6]，收縮壓≥140mmHg（1mmHg＝0.133kPa）和（或）舒張壓≥90mmHg。根據是否合并高血壓，將患者分為OSAHS合并高血壓組（145例）和單純OSAHS組（155例）。同時募集同期健康受試者100例，均為漢族男性，做為健康對照組。

1.2 方法

所有患者均在睡前測量身高、體質量、血壓，并進行OSAHS和高血壓疾病的詢問和嗜睡問卷調查，行≥7h的整夜多導睡眠圖（polysomnography，PSG）監(jiān)測。晨起后抽取靜脈血5ml，其中2ml用EDTA抗凝，置于-20℃冰箱用于提取基因組DNA，另外3ml非抗凝血分離血清后用于空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）等指標的檢測。

1.3 SNP分析

（1）基因組DNA的抽提：常規(guī)酚?氯仿法抽提基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA的質與量，低溫冰箱保存。（2）引物合成：引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，各位點引物序列，見表1。（3）多重PCR擴增：PCR反應體系DNA 1μl，10×PCR緩沖液1.5μl，MgCl21.5μl，dNTP 0.3μl，引物混合0.15μl，Taq酶0.3μl，去離子水補至15μl。擴增條件：95℃ 3min，94℃ 15s，60℃ 15s，共11個循環(huán)，72℃ 30s，然后進行94℃ 15s，54℃ 15s，72℃ 30s，共24個循環(huán)，最后72℃ 3min。（4）PCR產物純化：PCR擴增后取3μl PCR產物用Ⅰ和FastAP純化（ExoⅠ去除反應產物中的剩余引物，F(xiàn)astAP去除反應中剩余的dNTP）。具體為PCR產物3μl，Ⅰ 0.2μl，F(xiàn)ast AP 0.8μl，Ⅰ緩沖液0.7μl，去離子水補至7μl，37℃ 15min，80℃15min，純化后進行延伸反應，預先混好延伸引物。（5）延伸反應：PCR產物2μl，Snapshot Mix試劑1μl，延伸引物混合2μl，去離子水補至6μl。條件為96℃ 1min，然后96℃ 10s，52℃ 5s，60℃ 30s，共30個循環(huán)。（6）測序：取1μl延伸產物，加8μl上樣，95℃變性3min，立即冰水浴，上測序儀（型號ABI 3730XL）測序。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 CRP的SNP分析

rs3091244的基因類型以CC型和AC型為主，CC型和AC型在各組之間的基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。但rs3091244的CT型基因在OSAHS合并高血壓組與單純OSAHS組的基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義，OSAHS合并高血壓組CT型基因比例較單純OSAHS組增高（＜0.05）。并且OSAHS合并高血壓組rs3091244的T等位基因頻率也較單純OSAHS組明顯增高（＜0.05；表2）。

表1 CRP基因SNP位點

表2 CRP基因型分析

CRP: C-reactive protein; OSAHS: obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome. Compared with OSAHS group,*＜0.05,**＜0.01

rs1205的基因類型有CT型、TT型和CC型3種，CT型和TT型基因在各組之間的基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。但rs1205的CC基因型在OSAHS合并高血壓組中明顯高于單純OSAHS組（＜0.05）。各基因型在對照組與單純OSAHS組和OSAHS合并高血壓組之間差異均無統(tǒng)計學意義（＞0.05；表2）。

3 討 論

慢性炎癥是OSAHS相關高血壓發(fā)病的重要原因之一[7]。CRP是在炎癥時由白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）誘導肝臟合成的一種典型的急時相蛋白，是臨床上判斷炎癥發(fā)生、發(fā)展和程度的敏感指標[8]。CRP基因多態(tài)性與炎癥的程度相關[9]。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS相關高血壓的發(fā)病存在不均質性，相同嚴重程度的OSAHS引起慢性炎癥的程度并不相同[10]，CRP和IL-6等炎癥因子在OSAHS相關高血壓患者中明顯升高[11]。其原因考慮可能與炎癥因子的SNP有關。

國外測序研究發(fā)現(xiàn)，CRP基因的SNP在不同人群中有較大差異，在非洲黑人中發(fā)現(xiàn)30個SNP[12]，歐美白人中發(fā)現(xiàn)13個SNP[13]，亞裔混合人群（中國人、日本人和南亞人）中發(fā)現(xiàn)17個SNP[14]。國內劉海行等[15]對正常漢族自然人群血清CRP水平按十分位進行分層，觀察CRP基因多態(tài)性與血清CRP的關系。研究發(fā)現(xiàn)血清CRP高水平組中rs3091244T等位基因頻率高于低水平組，說明rs3091244T等位基因與漢族自然人群中血清高CRP水平有關。他們還發(fā)現(xiàn)rs1205T等位基因攜帶者中rs3091244T的血清CRP水平是rs3091244G的21倍，因此認為rs1205對rs3091244的T等位基因高CRP水平有效應修正作用。即rs1205T等位基因會使rs3091244T的作用進一步放大。日本學者Morita等[16]發(fā)現(xiàn)，rs3091244T等位基因與正常人血清CRP水平相關，高水平CRP人群中，rs3091244T等位基因頻率增高。說明在亞裔人群中rs3091244T等位基因與血清高CRP水平可能具有一定的普遍性。他們還發(fā)現(xiàn)rs3091244T等位基因與脈搏波速率（pulse wave velocity，PWV）相關，說明rs3091244T等位基因可能是一個重要的功能基因。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在OSAHS合并高血壓組中，rs3091244的CT型基因頻率高于單純OSAHS組，提示rs3091244的CT型基因可能與OSAHS合并高血壓有關。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)OSAHS合并高血壓組患者血清中CRP水平明顯增高，因此認為rs3091244的CT型基因可能通過增加血清CRP水平，引起體內慢性炎癥，從而在高血壓的發(fā)生中產生作用。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，rs1205的CC基因型在OSAHS合并高血壓組中明顯升高，為25%，而單純OSAHS組為11%，說明其在OSAHS合并高血壓的過程中也具有重要作用。劉海行等發(fā)現(xiàn)rs1205等位基因會在正常狀態(tài)時對rs3091244基因的功能有放大作用，我們認為rs1205的CC基因型在疾病狀態(tài)下也可能具有直接增加血清CRP的作用。

綜上所述，我們的研究顯示，CRP的SNP與OSAHS合并高血壓有關，rs3091244的CT型基因和rs1205的CC型基因可能通過增加血清CRP水平，引起體內慢性炎癥，從而在高血壓的發(fā)生中產生作用。

[1] Mohsenin V. Obstructive sleep apnea and hypertension: a critical review[J]. Curr Hypertens Rep, 2014, 16(10): 482.

[2] Cohen DL, Townsend RR.Obstructive sleep apnea and hypertension[J]. J Clin Hypertens (Greenwich), 2013, 15(10): 703.

[3] Li TZ, Qian XS, Guo RB,. Relation between TNF-α polymorphism and obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome accompanying hypertension[J]. Acad J Chin PLA Med Sch, 2013, 34(12): 1265?1268. [李天志, 錢小順, 郭瑞表, 等. TNF-α基因多態(tài)性與睡眠呼吸暫停低通氣綜合征合并高血壓的關系[J]. 解放軍醫(yī)學院學報, 2013, 34(12): 1265?1268.]

[4] Li XH, Qian XS, Li TZ,. Obstructive sleep apnea syndrome complicated by hypertension and insulin resistance[J]. Acad J Chin PLA Postgrad Med Sch, 2010, 31(4): 339?340. [黎曉暉, 錢小順, 李天志, 等. 睡眠呼吸暫停綜合征合并高血壓與胰島素抵抗的研究[J]. 軍醫(yī)進修學院學報[J]. 2010, 31(4): 339?340.]

[5] Chinese Society of Respiratory, Chinese Medical Association. The Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Obstructive Sleep Apnea-Hypopnea Syndrome (2011 Revision)[J]. Chin J Tuberc Respir Dis, 2012, 35(1): 9?12. [中華醫(yī)學會呼吸病學分會睡眠呼吸障礙學組. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2012, 35(1): 9?12.]

[6] Writing Group of Chinese Guidelines for the Management of Hypertension.2010 Chinese Guidelines for the Management of Hypertension[J]. Chin J Hypertens, 2011, 19(8): 701?743. [《中國高血壓防治指南》修訂委員會. 中國高血壓防治指南2010[J]. 中華高血壓雜志, 2011, 19(8): 701?743.]

[7] Qian XS, Liu CT. Advances in research of chronic low-grade systemic inflammation caused by obstructive sleep apnea syndrome[J]. Acad J Chin PLA Postgrad Med Sch, 2009, 30(3): 399?400. [錢小順, 劉長庭. 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征致慢性低度系統(tǒng)性炎癥的研究進展[J]. 軍醫(yī)進修學院學報, 2009, 30(3): 399?400.]

[8] Meier-Ewert HK, Ridker PM, Rifai N,. Effect of sleep loss on C-reactive protein, an inflammatory marker of cardiovascular risk[J]. J Am Coll Cardiol, 2004, 43(4): 678–683.

[9] Kocarnik JM, Pendergrass SA, Carty CL,. Multiancestral analysis of inflammation-related genetic variants and C-reactive protein in the population architecture using genomics and epidemiology study[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2014, 7(2): 178?188.

[10] Qian XS, Li TZ, Sun BJ.. Correlation between interleukin level and hypertension in obstructive sleep apnea syndrome patients[J]. Acad J Chin PLA Postgrad Med Sch, 2009, 30(3): 349?350. [錢小順, 李天志, 孫寶君,等. 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者炎癥因子水平與合并高血壓病關系的研究[J]. 軍醫(yī)進修學院學報, 2009, 30(3): 349?350.]

[11] Qian X, Yin T, Li T,. High levels of inflammation and insulin resistance in obstructive sleep apnea patients with hypertension[J]. Inflammation, 2012, 35(4): 1507?1511.

[12] Crawford DC, Sanders CL, Qin X,. Genetic variation is associated with C-reactive protein levels in the Third National Health and Nutrition Examination Survey[J]. Circulation, 2006, 114(23): 2458?2465.

[13] Verzilli C, Shah T, Casas JP,. Bayesian meta-analysis of genetic association studies with different sets of markers[J]. Am J Hum Genet, 2008, 82(4): 859?872.

[14] Crawford DC, Yi Q, Smith JD,. Allelic spectrum of the natural variation in CRP[J]. Hum Genet, 2006, 119(5): 496?504.

[15] Liu HH, Zhao D, Wang W,. Gene sequencing of C-reactive protein and the association between its polymorphisms and serum concentration[J]. J Cardiol Pulmo Dis, 2010, 29(6): 521?524. [劉海行, 趙 冬, 王 薇, 等. C-反應蛋白全基因測序及基因變異與血清水平的關聯(lián)[J]. 心肺血管病雜志, 2010, 29(6): 521?524.]

[16] Morita A, Nakayama T, Doba N,. Polymorphism of the C-reactive protein (CRP) gene is related to serum CRP level and arterial pulse wave velocity in healthy elderly Japanese[J]. Hypertens Res, 2006, 29(5): 323?331.

（編輯: 周宇紅）

Correlation of C-reactive protein polymorphism with hypertension in patients with obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome

QIAN Xiao-Shun1, LIU Wei2, SUN Jing3, LI Tian-Zhi1, GUO Rui-Biao1, SUN Bao-Jun1

(1Department of Geriatric Respiratory Diseases,3Health Service Office, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Respiratory Diseases, Chinese PLA Hospital No.302, Beijing 100039)

To investigate the correlation of single nucleotide polymorphism (SNP) of C-reactive protein(CRP) with hypertension induced by obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS).A total of 300 male patients diagnosed as severe OSAHS by polysomnography in our department from January 2006 to December 2012 were enrolled in this study. One hundred and forty-five of them were identified having hypertension. Another 100 healthy males randomly sampled served as normal controls. SNPs of the promoter region of CRP rs3091244 and rs1205 were detected in those OSAHS patients with or without hypertension, and health individuals. Statistical analysis was performed to evaluate the correlation between SNP of CRP and OSAHS with or without hypertension.The frequency of CT genotype in CRP rs3091244 was significantly higher in the OSAHS patients with hypertension than those without (17%7%), so was the frequency of T allele in rs3091244 (9%3%). The frequency of CC genotype in CRP rs1205 was also higher in the OSAHS patients with hypertension than those without (25%11%).CRP SNP is correlated with hypertension in the OSAHS patients. The CT genotype of CRP rs3091244 and the CC genotype of rs1205 may cause chronic inflammation and promote the occurrence of hypertension through enhancing serum CRP level.

C-reactive protein; sleep apnea, obstructive; hypertension; single nucleotide polymorphism

(2012FC-CXYY-4006).

R563.8; R544.1

A

10.11915/j.issn.1671?5403.2015.01.012

2014?09?05;

2014?12?04

解放軍總醫(yī)院臨床重大創(chuàng)新預研項目（2012FC-CXYY-4006）

錢小順, E-mail: qianxs@yahoo.com