一種鉑類抗腫瘤藥用藥指導(dǎo)的多重SNP 檢測方法

南麗 姜丹 孔咪咪

(寧波海爾施基因科技有限公司 浙江 寧波 315800)

鉑類藥物是目前臨床上最常用的腫瘤化療藥物之一，包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國抗癌化療治療方案中，以順鉑為主或有順鉑參加配伍的方案占所有化療方案的70% ～80%。但在鉑類藥物的臨床應(yīng)用中，卻存在治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個(gè)體差異。研究表明，人群對鉑類藥物的個(gè)體差異與多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)密切相關(guān)。其中6 個(gè)基因的8 個(gè)SNP 位點(diǎn):TPMT 的rs1142345 和rs18004601 位點(diǎn)、ERCC1 rs116152、XRCC1 rs254873、COMT 的rs4646316和rs93323771 位點(diǎn)、GSTP1 rs16954 及XPC rs22280015 尤其重要，用藥前檢測這些位點(diǎn)，可協(xié)助醫(yī)生評估順鉑治療后毒性風(fēng)險(xiǎn)、對患者是否有效及治療后生存時(shí)間、總體生存時(shí)間及死亡風(fēng)險(xiǎn)。

本研究開發(fā)了一種用于鉑類用藥指導(dǎo)的多重基因檢測試劑盒(以下簡稱:鉑類試劑盒)，同步特異性擴(kuò)增與鉑類用藥相關(guān)的6 個(gè)基因8 個(gè)SNP 位點(diǎn)的等位基因類型，為醫(yī)生和患者提供了一種鉑類用藥指導(dǎo)的新型檢測方案。

1.材料和方法

1.1 DNA 提取:以抗凝靜脈血作為樣本進(jìn)行DNA 提取。DNA 提取在自動化提取工作站Smart LabAssist－32(臺灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)有限公司)上完成。試劑盒使用"核酸自動提取試劑盒(磁珠法)"(寧波海爾施基因科技，貨號:1060055)。

1.2 PCR 擴(kuò)增:PCR 擴(kuò)增反應(yīng):鉑類PCR 預(yù)混液16μL、Taq DNA 聚合酶2μL、樣品DNA /鉑類陽性對照2μL。混勻后按以下溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng):94℃3 分鐘;94℃30 秒，60℃30 秒，70℃30 秒，共35 個(gè)循環(huán);72℃3 分鐘;4℃保存產(chǎn)物。

1.3 DNA 片段分離:采用遺傳分析儀(3500/3130，美國生命公司或GeXP，美國貝克曼庫爾特公司)進(jìn)行DNA 片段分離，詳見說明書。

2.結(jié)果

鉑類試劑盒檢測人DNA 樣品，因每個(gè)SNP 位點(diǎn)有可能出現(xiàn)2 個(gè)基因型峰，故共可能出現(xiàn)12 －20 個(gè)特征峰，其中8 －16 個(gè)為SNP 特征峰、3 個(gè)人DNA 內(nèi)參特征峰(BC－1、BC－3、BC－4)和1 個(gè)PCR 反應(yīng)內(nèi)參pcDNA特征峰(圖1)。鉑類陽性對照檢測結(jié)果應(yīng)出現(xiàn)全部20 個(gè)特征峰。

圖1、本試劑盒檢測人基因組DNA 結(jié)果舉例。共出現(xiàn)16 個(gè)特征峰:8 個(gè)SNP 位點(diǎn)有4 個(gè)雜合子(XRCC1、TPMT－1、TPMT－2 和XPC)，即12 個(gè)基因型峰和4 個(gè)內(nèi)參峰。

3.討論

目前常用的SNP 檢測方法:qPCR 法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，其缺點(diǎn)是通量低且探針成本高;DNA 芯片有高通量等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)為成本昂貴、靈敏度低、重復(fù)性差且準(zhǔn)確性低;Sanger 測序法是SNP 分析金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知SNP 和未知SNP，缺點(diǎn)是工作量大，周期長，多位點(diǎn)檢測累計(jì)價(jià)格相對昂貴。

本研究提供了一種快速、準(zhǔn)確同步檢測多個(gè)SNP 位點(diǎn)用于指導(dǎo)鉑類用藥指導(dǎo)的新方法。目前，國內(nèi)外尚無類似的研究報(bào)道。

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