王素梅，張淑娟，王艷輝，時(shí)廣明，白彩霞，秦光彪，劉玉峰，陳曉華

(1.黑龍江職業(yè)學(xué)院，雙城150111; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，哈爾濱150086)

人工授精(AI) 是使用器械采集公畜的精液，再用器械把經(jīng)過(guò)檢查和處理后的精液輸入到母畜生殖道內(nèi)，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一種繁殖技術(shù)，被稱(chēng)為家畜繁殖領(lǐng)域的第一次革命。精液冷凍保存是人工授精技術(shù)的一項(xiàng)重大革新，它解決了精液長(zhǎng)期保存的問(wèn)題，使精液不受時(shí)間、地域和種畜生命的限制，它是推動(dòng)AI 技術(shù)快速發(fā)展的重要?jiǎng)恿?。影響犬冷凍精液人工授精效果的因素眾多?］。本試驗(yàn)旨在通過(guò)雜種寵物犬精液冷凍過(guò)程中稀釋操作和不同劑型間犬凍精冷凍效果的影響，以便為以后國(guó)內(nèi)相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器材

隨機(jī)挑選6 只雜種寵物公犬分成A、B 兩組。要求犬只健康、性欲強(qiáng)、性情溫順、無(wú)傷人史，年齡在2 ～8 歲。每日飼喂牡丹江新中旭狐貉全價(jià)配合飼料，每天定時(shí)、定量由固定飼養(yǎng)員飼喂，自由飲水。采精期間每天適當(dāng)補(bǔ)充蛋白質(zhì)，同時(shí)每只公犬每天補(bǔ)飼雞蛋一枚。

試劑及儀器: 果糖、Tris(三羥基甲基甲烷) 、檸檬酸鈉、卵黃、甘油、青霉素、鏈霉素。犬用集精杯、溫度計(jì)、漏斗、天平、消毒鍋、細(xì)管、光學(xué)顯微鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精液采集

采用手握法進(jìn)行采精。采精前對(duì)公犬進(jìn)行調(diào)教1 周，使其熟悉采精環(huán)境，安排在每天早、晚進(jìn)行，使公犬形成穩(wěn)定的條件反射。采精時(shí)，在同一時(shí)間、同一地點(diǎn)，均采用手握法進(jìn)行采精。每天每只犬采集1 次精液，然后分為兩份。

1.2.2 精液處理

采精后，立即對(duì)精液進(jìn)行常規(guī)檢查，包括精液顏色、氣味、精液量、精子活力、密度、畸形率、頂體完整率等項(xiàng)目。精子活力采用十級(jí)評(píng)分制，其余操作正常進(jìn)行。檢查后，按設(shè)計(jì)要求進(jìn)行稀釋、分裝和保存處理。

1.2.3 精液稀釋液配方確定及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)國(guó)內(nèi)外進(jìn)行犬精液冷凍研究中應(yīng)用最廣泛的稀釋液配方，以?xún)鼍慕鈨龊缶踊盍ψ鳛樵u(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)及禹學(xué)禮等實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合自己的一些改進(jìn)，確定犬精液冷凍稀釋液為T(mén)ris-果糖稀釋液。配方分為兩部分，分別是I 液和II 液。其中I 液包括Tris 3.025g，果糖1.7 g，檸檬酸鈉1.36 g，甘油3 mL，雙蒸水100 mL; II 液包括Ⅰ液76 mL，卵黃20 mL，甘油5 mL，青霉素1 000 IU/mL，鏈霉素1 000 μg/mL。

本試驗(yàn)中對(duì)采集的新鮮精液進(jìn)行品質(zhì)檢查后，分別用事先配制好的Tris-果糖稀釋液采用一步稀釋法和兩步稀釋法均按照1∶2 倍進(jìn)行稀釋。兩種稀釋方法均采用降溫2 h 至4℃，再平衡2 h 的方法進(jìn)行。一步稀釋法和兩步稀釋法的細(xì)管精液均在平衡后通過(guò)自制恒溫設(shè)施下進(jìn)行分裝，然后通過(guò)熏蒸法進(jìn)行顆粒凍精以及細(xì)管凍精的凍結(jié)。樣品凍結(jié)面距離液氮面高度為1.0 cm，停留5 min，然后待精液凍結(jié)后，迅速將精液移入液氮中。

本實(shí)驗(yàn)以雜種寵物犬精液的精子活力作為評(píng)定指標(biāo)，用兩種精液稀釋法冷凍犬精液，分別比較三種冷凍方式下精液冷凍前后精子活力的優(yōu)劣，以探索常規(guī)方式下寵物犬精液冷凍程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一稀釋法不同劑型冷凍效果比較

經(jīng)SPSS 檢驗(yàn)，采用一步稀釋法的顆粒凍精的解凍后活力(0.37 ±0.01) 與0.25 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.35 ±0.01) 和0.5 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.32 ±0.01) 的差異均顯著(P ＜0.05) ，而0.25 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.35 ±0.01)與0.5 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.32 ±0.01) 的差異極顯著(P ＜0.01) ，這與禹學(xué)禮等［1］試驗(yàn)結(jié)果基本一致; 采用兩步稀釋法的顆粒凍精的解凍后活力(0.40 ±0.01) 與0.25 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.39 ±0.01) 以及0.5 mL 細(xì)管凍精的解凍后精子活力(0.36 ±0.02) 的差異均不顯著(P ＞0.05)(見(jiàn)表1) 。

表1 同一稀釋法不同劑型解凍后精子活力效果比較

2.2 不同稀釋方法精液冷凍效果比較

經(jīng)SPSS 檢驗(yàn)，顆粒凍精采用一步稀釋法的解凍后精子活力(0.37 ±0.01) 與采用兩步稀釋法的解凍后精子活力(0.40 ±0.01) 差異不顯著(P ＞0.05) ; 0.25 mL 細(xì)管凍精采用一步稀釋法的解凍后精子活力(0.35 ±0.01) 與采用兩步稀釋法的解凍后精子活力(0.39 ±0.01) 差異顯著(P ＜0.05) ;0.5 mL 細(xì)管凍精采用一步稀釋法的解凍后精子活力(0.32 ±0.01) 與采用兩步稀釋法的解凍后精子活力(0.36 ± 0.02) 差異不顯著(P ＞0.05) (見(jiàn)表2) 。

表2 不同稀釋方法冷凍精液劑型解凍后精子活力比較

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，雜種寵物犬精液冷凍保存時(shí)采用一步稀釋法顆粒凍精的冷凍效果比0.25 mL 細(xì)管和0.5 mL 細(xì)管均好，而兩步稀釋法對(duì)不同凍精劑型的影響不明顯。

因此，可以考慮以后對(duì)犬精液進(jìn)行冷凍均采用兩步稀釋法，這與Pena A.等的研究發(fā)現(xiàn)先用含低濃度甘油(3%) 稀釋液稀釋精子，再用含高濃度甘油(7%) 稀釋液等倍稀釋后的精液在解凍后質(zhì)量更佳的研究結(jié)果相一致［2］。

［1］禹學(xué)禮，龐有志.犬精液冷凍與人工授精的進(jìn)展［J］.洛陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，1999，6.

［2］Pena A，Linde-Forsberg C.Effects of Equex，one or two stip dilution，and two freezing and trawing rates on post- thaw survival of dog spermatoa ［J］.Theriogenology，2000，54: 859 ～875.