INHA在多浪羊和卡拉庫(kù)爾羊卵巢的定位

靳興濤，王惠娥 ，繆增強(qiáng)，蘇勇華

(塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300)

卵泡發(fā)育是一個(gè)以形態(tài)變化為特征的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程，同時(shí)伴有卵泡功能的分化。原始卵泡經(jīng)過(guò)發(fā)育和分化可形成優(yōu)勢(shì)卵泡，使卵子成熟并排出，也可中途閉鎖［1］。抑制素是下丘腦 垂體 性腺軸調(diào)控系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)激素，對(duì)卵泡的正常生長(zhǎng)、分化及閉鎖起到刺激或抑制作用。抑制素對(duì)FSH 具有調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被許多研究所證實(shí)，但它作用機(jī)制目前尚有爭(zhēng)議。

抑制素(Inhibin，INH) 是雄性動(dòng)物的睪丸支持細(xì)胞C 和雌性動(dòng)物的卵巢顆粒細(xì)胞所分泌的二聚體糖蛋白激素。抑制素基因由α 亞基和β 亞基通過(guò)二硫鍵連接而成，β 亞基包括βA 和βB 兩種形式，α 亞基分別與這兩種亞基結(jié)合形成INHA 和INHB［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物胚胎期、新生動(dòng)物卵巢及成年雌性動(dòng)物卵巢中均可以檢測(cè)到抑制素亞基基因的表達(dá)，但抑制素的不同亞基基因表達(dá)的具體時(shí)間和表達(dá)量在不同物種中存在著很大的差異［4］。Robertson DM［5］等認(rèn)為，抑制素可以阻斷促性腺激素釋放激素(GnRH) 受體的合成，也可作為GnRH的阻滯劑，主要阻斷了GnRH 受體后水平的信息傳遞，從而降低了細(xì)胞對(duì)GnRH 的反應(yīng)性。而B(niǎo)icsak［6］等認(rèn)為，抑制素可直接通過(guò)調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性來(lái)影響垂體FSH 合成。許多試驗(yàn)證明，用不同類型的抑制素免疫原免疫動(dòng)物，均可引起血FSH 水平增加，而對(duì)黃體化激素LH 沒(méi)有直接作用，被免疫動(dòng)物循環(huán)LH 水平無(wú)明顯變化。但也有體外試驗(yàn)表明，豬抑制素制備物可加強(qiáng)綿羊垂體細(xì)胞GnRH 誘導(dǎo)的LH 釋放，而抑制素對(duì)GnRH 誘發(fā)的鼠垂體細(xì)胞FSH 和LH 釋放均表現(xiàn)為抑制作用。這說(shuō)明抑制素對(duì)LH 的作用可能存在種間差異。

本研究擬針對(duì)上述實(shí)際存在的問(wèn)題，對(duì)新疆多浪羊和卡拉庫(kù)爾羊兩個(gè)地方品種利用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行卵巢上INHA 的特異性免疫組織化學(xué)染色分析，希望從中發(fā)現(xiàn)它們的某些分布變化規(guī)律，從而為有針對(duì)性地建立不同地方綿羊品種的卵泡發(fā)育體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在新疆喀什莎車縣，選取健康、發(fā)育良好的未孕雌性多浪羊和卡拉庫(kù)爾羊各10 只，2 ～3 歲。屠宰后取卵巢組織，置于4%甲醛固定液中。

1.2 主要試劑

兔抗INHA 抗體，抗兔SP 免疫試劑盒，DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。國(guó)產(chǎn)分析純有磷酸緩沖液(PBS) 、加拿大樹(shù)脂、檸檬酸緩沖液自配。

1.3 切片標(biāo)本制備

甲醛固定好的卵巢組織修正后梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度6～8 μm。

1.4 INHA 免疫組織化學(xué)染色程序

參考王惠娥文獻(xiàn)［7，8］。

1.5 圖像分析

每樣本分別選取5 張陽(yáng)性切片，并隨機(jī)觀察每張片子的5 個(gè)視野，用image J 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞率(陽(yáng)性細(xì)胞面積/總細(xì)胞面積) 的均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用軟件SPSS 12.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用單因子方差分析進(jìn)行結(jié)果的差異顯著性檢驗(yàn)并進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)相關(guān)分析均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下的染色結(jié)果

圖1 抑制素A 在各級(jí)卵泡免疫組化定位

2.2 綿羊卵巢中抑制素的定位分布

由圖1 可以看出，免疫組化染色陽(yáng)性切片背景無(wú)色或淡藍(lán)色，抑制素A 免疫反應(yīng)細(xì)胞為黃色或棕黃色; 陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)中著有黃色或棕黃色反應(yīng)顆粒，蘇木素染成細(xì)胞核為淡藍(lán)色或藍(lán)色。對(duì)照組切片染色陰性，背景無(wú)色或淡藍(lán)色，無(wú)黃色或棕黃色染色，說(shuō)明免疫組化SP 法分別具有抑制素A 免疫反應(yīng)的特異性。

2.3 卵巢中抑制素免疫反應(yīng)物質(zhì)的分布和圖像分析

光鏡下觀察抑制素A 陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在膜細(xì)胞和卵泡旁血管周圍間質(zhì)中。原始卵泡開(kāi)始就有抑制素A 陽(yáng)性物質(zhì)，初級(jí)卵泡單層高柱狀的顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。隨著卵泡的發(fā)育，卵泡膜細(xì)胞分化出來(lái)后即呈現(xiàn)較高的染色強(qiáng)度，其與卵泡體積大小無(wú)關(guān)。初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。

表1 卵泡抑制素A 陽(yáng)性細(xì)胞圖像分析

表2 各級(jí)卵泡抑制素A 陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度

由表1 可見(jiàn)，卡拉庫(kù)爾羊和多浪羊抑制素A陽(yáng)性細(xì)胞在卵泡發(fā)育各階段以及成熟卵泡的膜細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)都有表達(dá)。初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡中除了膜細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)表達(dá)抑制素A 陽(yáng)性外，卵母細(xì)胞也有表達(dá)，且隨著卵泡的增大，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率呈先遞增后遞減趨勢(shì)?？ɡ瓗?kù)爾羊和多浪羊初級(jí)、次級(jí)卵泡抑制素A 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。兩品種間比較，多浪羊各級(jí)卵泡抑制素A 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均比卡拉庫(kù)爾羊高，但差異不顯著(P ＞0.05) 。

由表2 可見(jiàn)，隨卵泡體積增大，陽(yáng)性膜細(xì)胞數(shù)量增多，卵泡腔出現(xiàn)并逐漸增大至大腔階段。膜細(xì)胞著色強(qiáng)度增強(qiáng)至腔前卵泡隨后減弱，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞著色強(qiáng)度變化不明顯，細(xì)胞間質(zhì)可見(jiàn)陽(yáng)性染色強(qiáng)度。

3 討論

3.1 抑制素在綿羊卵巢中的定位研究

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)綿羊抑制素的研究，主要側(cè)重編碼其各自相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)變化，而利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)其各自相應(yīng)蛋白產(chǎn)物表達(dá)變化的報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明抑制素陽(yáng)性物質(zhì)主要分布于卵泡膜細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)，而顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞中分布較少或沒(méi)有分布。

3.2 抑制素基因在兩個(gè)綿羊品種間卵巢中相對(duì)表達(dá)量

抑制素會(huì)對(duì)卵泡發(fā)育、分化和成熟及排卵的過(guò)程起作用。卵泡發(fā)育是一個(gè)以形態(tài)變化為特征的生長(zhǎng)過(guò)程，同時(shí)伴隨著卵泡功能的分化，原始卵泡經(jīng)過(guò)發(fā)育和分化后，可形成優(yōu)勢(shì)卵泡，使卵子成熟和排出，也可中途閉鎖。抑制素可通過(guò)自分泌及旁分泌對(duì)卵泡的正常生長(zhǎng)分化及閉鎖起到刺激或抑制卵泡優(yōu)勢(shì)化過(guò)程中，抑制素?cái)?shù)量逐漸增高。研究表明，在成年動(dòng)物，抑制素水平在動(dòng)情周期的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中變化最為明顯，這說(shuō)明優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇與抑制素表達(dá)有很大關(guān)系。Abdennebi［5］等通過(guò)對(duì)多胎的羅曼諾夫綿羊和單胎的法蘭西島綿羊研究發(fā)現(xiàn)，在小的有腔卵泡中，抑制素在顆粒細(xì)胞中有清晰的表達(dá)，但在卵細(xì)胞中，僅檢測(cè)到低水平的抑制素，在大的有腔卵泡中，抑制素水平在內(nèi)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有高度的表達(dá)。

由表1 和圖1 可以看出，多浪羊和卡拉庫(kù)爾羊初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡抑制素陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于(P ＜0.05) 原始卵泡和成熟卵泡。隨著卵泡發(fā)育，抑制素陽(yáng)性細(xì)胞率呈遞增趨勢(shì)，直至腔前卵泡達(dá)到最高峰，隨之卵泡成熟而下降。各級(jí)卵泡抑制素的表達(dá)量多浪羊均比卡拉庫(kù)爾羊表達(dá)量高，但差異不顯著(P ＞0.05) 。該結(jié)果與Abdennebi［5］等的結(jié)果相一致。他們通過(guò)對(duì)高產(chǎn)的ROM 羊和低產(chǎn)IF 羊的研究也發(fā)現(xiàn)，在大的成熟卵泡的顆粒細(xì)胞中，僅檢測(cè)到低水平的抑制素，在小的有腔卵泡中，抑制素水平在顆粒細(xì)胞中有高度的表達(dá)。金萱［9］等研究發(fā)現(xiàn)，出生后5 d 的大鼠所分化的顆粒細(xì)胞中開(kāi)始INHA 亞基基因表達(dá)，隨后逐漸增加至竇狀卵泡期達(dá)到高峰，健康的卵泡顆粒細(xì)胞中INHA 的活性強(qiáng)而卵母細(xì)胞中tPA 活性弱; 閉鎖卵泡卵母細(xì)胞中tPA 活性高，其顆粒細(xì)胞表達(dá)的INHA 的mRNA 活性較弱，說(shuō)明顆粒細(xì)胞表達(dá)的抑制素A 與卵母細(xì)胞tPA 活性存在密切關(guān)系。說(shuō)明在卵泡優(yōu)勢(shì)化過(guò)程中，抑制素起著非常重要的作用。抑制素作用于除了優(yōu)勢(shì)卵泡以外的其他卵泡，抑制其發(fā)育成熟，使其閉鎖，從而使優(yōu)勢(shì)卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵。

4 結(jié)論

多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊的抑制素陽(yáng)性物質(zhì)主要見(jiàn)于膜細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)。多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊在其初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡中抑制素的表達(dá)陽(yáng)性率都顯著高于其原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。且隨著卵泡的不斷增大，抑制素水平在腔前卵泡之前達(dá)到高峰，隨后下降。因此，這可能與卵泡優(yōu)勢(shì)化有關(guān)，進(jìn)而與多胎性有關(guān)。

［1］郭淑華.相關(guān)分子在哺乳動(dòng)物原始卵泡啟動(dòng)和生長(zhǎng)中的作用［J］.濰坊學(xué)院學(xué)報(bào).2010，(06).

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