REM-PCL對犬缺血再灌注心肌線粒體抗氧化能力的影響*

方華 楊淼 張偉晶 章建平 張競超 章放香

缺血再灌注損傷心肌線粒體功能障礙與線粒體抗氧化能力及膜結(jié)構(gòu)的變化有密切關(guān)系[1-2]。瑞芬太尼聚己內(nèi)酯（remifentanil-poly-caprolactone，REM-PCL） 是 一 種 自行研制開發(fā)并已獲得國家正式授權(quán)的緩釋Mu阿片受體（μ-opioid receptor，MOR）激動劑，筆者的前期研究已證實REM-PCL預處理能夠模擬缺血預處理對缺血再灌注心肌產(chǎn)生保護作用。本研究旨在探討REM-PCL對體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）中犬心肌細胞線粒體膜結(jié)構(gòu)和抗氧化能力的影響，為REM-PCL在CPB中心肌保護的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 REM-PCL（中國發(fā)明專利號：200810045272.8）為自行研制開發(fā)的新型高分子MOR激動劑，已證實能有效激活MOR。總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒（均為中國上海研吉生物科技有限公司）。

1.2 動物分組及模型的建立 選擇健康成年雜種犬12條（貴陽醫(yī)學院動物實驗中心提供），體質(zhì)量12~18 kg，雌雄不拘，隨機分為REM-PCL組（RP組）和對照組（C組），每組6只。動物腹腔內(nèi)注射2.5%戊巴比妥鈉25 mg/kg麻醉后行氣管內(nèi)插管，連接Puritan-Bennett呼吸機行機械通氣。股動、靜脈置管監(jiān)測中心靜脈壓（CVP）和平均動脈壓（MAP）。采用胸骨正中切口，全身肝素化后右心房和左鎖骨下動脈分別插管，連接Sarns5000型人工心肺機（美國3M公司）、科威97型鼓泡式氧合器（廣東科威醫(yī)療用品有限公司）建立CPB。CPB前5 min，調(diào)節(jié)循環(huán)溫度至28~30 ℃，RP組與C組分別經(jīng)股靜脈注射REM-PCL 0.2 mg/kg及等量生理鹽水。穩(wěn)定并行循環(huán)5 min后阻斷升主動脈，主動脈根部灌入4 ℃St.Thomas停搏液（10 mL/kg），轉(zhuǎn)機流量為60~80 mL/（min·kg），阻斷升主動脈60 min。開放升主動脈后觀察循環(huán)情況60 min。

1.3 指標測定 采用差速離心法提取心肌線粒體[3-4]。分別于CPB前、缺血60 min、再灌注60 min時取左心室前壁心肌，0~4 ℃冰浴中的燒杯中按照1∶9（w/v）心肌組織比例分別加入 10 mol/L Tris-HCI， 0.075 mol/L sucrose，0.05 mol/L EDTA，0.225 mol/L D-mannitol pH 7.4分離液超聲勻漿及4 ℃中600×g離心5 min后，分離液懸浮沉淀并再次超聲勻漿，4 ℃中600×g離心5 min所得到的上清液再以4 ℃中10 000×g離心10 min，所得沉淀即為心肌組織線粒體。線粒體懸液蛋白濃度采用考馬斯亮藍法測定并檢測線粒體懸液520 nm處吸光度值作為線粒體腫脹度（mitochondrial swelling degree，MSD）指標[3]。分別取10 g/L的線粒體50 μL測定T-AOC和SOD，100 g/L的線粒體0.2 mL測定GSH-PX和MDA。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞線粒體MSD和MDA的變化 線粒體腫脹表現(xiàn)為520 nm處吸光值的降低。C組MDA和MSD在缺血60 min、再灌注30 min和60 min時與轉(zhuǎn)機前比較均明顯增加（P<0.01），RP組在缺血60 min和再灌注30 min時MDA和MSD均顯著增加（P<0.05或0.01），RP組在再灌注60 min時MDA和MSD與轉(zhuǎn)機前比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。RP組在缺血60 min、再灌注30 min和60 min時MDA和MSD均低于C組（P<0.01），見表1。

2.2 心肌線粒體T-AOC、GSH-PX及SOD的變化 C組與轉(zhuǎn)機前比較，T-AOC、GSH-PX及SOD在缺血60 min、再灌注30 min和60 min時均顯著降低（P<0.01），RP組在缺血60 min和再灌注30 min時T-AOC、GSH-PX及SOD均降低（P<0.05），RP組在再灌注60 min時T-AOC、GSHPX及SOD均恢復至轉(zhuǎn)機前水平（P>0.05）。RP組在缺血60 min、 再 灌 注 30 min和 60 min時 T-AOC、GSH-PX及SOD均高于C組（P<0.01），見表1。

表1 兩組心肌線粒體MDA、MSD、T-AOC、GSH-PX及SOD的比較（±s）

表1 兩組心肌線粒體MDA、MSD、T-AOC、GSH-PX及SOD的比較（±s）

*P<0.05，△P<0.01，與轉(zhuǎn)機前比較；#與同期C組比較，P<0.01

組別 指標 MSD（A520 nm） MDA（nmol/mg prot） GSH-PX（μmol/L） SOD（NU/mg prot）T-AOC（U/mg prot）C組（n=6）轉(zhuǎn)機前 9.3±0.4 1.6±0.9 57.6±10.4 34.9±7.4 38.4±6.5缺血60 min 4.3±1.3△ 6.4±1.4△ 46.3±8.8△ 21.6±4.4△ 26.3±4.9△再灌注30 min 3.3±0.9△ 8.5±1.2△ 40.7±7.5△ 16.7±6.8△ 15.5±4.2△再灌注60 min 2.5±1.2△ 9.2±1.5△ 36.5±7.2△ 15.8±4.4△ 16.6±5.7△RP組（n=6）轉(zhuǎn)機前 9.2±1.1 1.8±0.7 59.8±9.4 35.3±6.9 36.1±4.9缺血 60 min 7.7±1.9△# 4.6±1.1△# 52.2±7.9*# 26.8±5.9*# 31.3±5.6*#再灌注30 min 8.2±1.8*# 4.9±0.9*# 53.1±9.8*# 27.3±5.4*# 31.4±6.3*#再灌注60 min 9.6±1.7# 1.9±0.6# 57.6±8.3# 30.6±5.2# 33.4±6.2#

3 討論

線粒體是心肌細胞能量代謝的主要場所，心肌細胞的功能狀態(tài)與線粒體膜功能和抗氧化能力的改變有著密切的關(guān)系。CPB中手術(shù)操作、溫度改變、缺血以及再灌注等均可引起心肌細胞線粒體功能障礙，導致心肌收縮力下降，出現(xiàn)心功能衰竭及心律失常等并發(fā)癥[5-7]。

本研究中，CPB期間心肌缺血后C組代表線粒體內(nèi)抗氧化能力的T-AOC、抗氧化酶GSH-PX和SOD均明顯降低，與此同時，MSD與反映脂質(zhì)過氧化程度的終產(chǎn)物心肌細胞線粒體MDA含量均顯著升高；再灌注后C組T-AOC、GSH-PX和SOD未見恢復，相反較缺血期間進一步下降，MSD與MDA進一步升高，說明CPB引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應通過破壞心肌細胞線粒體氧化與抗氧化平衡[8-10]，使線粒體膜功能及結(jié)構(gòu)的完整性遭到損害；提示心肌線粒體膜結(jié)構(gòu)及功能的維持與心肌缺血再灌注過程中線粒體氧化與抗氧化的動態(tài)平衡有密切聯(lián)系[8-9]。

線粒體膜及膜蛋白結(jié)構(gòu)的完整性是心肌舒縮功能順利完成的重要保障[11-13]。在對MSD的影響方面，本研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射REM-PCL 0.2 mg/kg對線粒體膜結(jié)構(gòu)有明顯的保護作用，這種作用主要表現(xiàn)在開放主動脈后的過程中，RP組線粒體腫脹度顯著低于相應時點C組，并逐漸恢復至CPB前水平，說明CPB中REM-PCL對線粒體膜等均有很好的保護作用。REM-PCL預處理減輕心肌缺血再灌注損傷的機制與激活MOR有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MOR屬于G蛋白藕聯(lián)受體，通過G蛋白與線粒體KATP通道相鏈接[14-16]。REM-PCL可能通過活化MOR來激活線粒體KATP通道來清除氧自由基，降低組織細胞代謝率， 可能也是增強機體抗氧化能力的機制之一[17-18]。本研究從氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應入手，CPB中應用REM-PCL預處理可增加心肌線粒體SOD、GSH-Px活性，降低線粒體MDA含量，在一定程度上清除氧自由基以及降低氧自由基的介導放大效應，使過度的脂質(zhì)過氧化反應得到控制。提示REM-PCL可有效抑制氧自由基對線粒體膜的氧化損傷，說明CPB中REM-PCL預處理可以有效減輕線粒體氧化應激程度，提升心肌線粒體抗氧化能力，對心肌細胞線粒體起到較好的保護作用。

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