牛大力多糖在小鼠模型抗肝炎作用的試驗(yàn)觀察

曹志方，郝赫宣，楊雨輝，陳 濤，姜亞磊，王金花

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?70228；2.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口570228）

牛大力多糖在小鼠模型抗肝炎作用的試驗(yàn)觀察

曹志方1，郝赫宣1，楊雨輝2，陳 濤1，姜亞磊1，王金花1

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南海口570228；2.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

為了確定牛大力中多糖成分是否具有保肝、抗炎的作用。本試驗(yàn)采用小鼠急性肝損傷模型對(duì)牛大力多糖的保肝、抗炎作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，牛大力多糖對(duì)肝損傷引起的肝臟腫大有明顯地抑制效果，抑制率高達(dá)72.18%；肝組織切片也顯示其對(duì)肝臟細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的完整性具有保護(hù)作用。牛大力多糖還能降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶（P＜0.01）的活性，明顯抑制丙二醛（P＜0.05）的生成，同時(shí)降低炎性介質(zhì)關(guān)鍵酶環(huán)氧化酶-2（P＜0.05）的表達(dá)，從而抑制炎性介質(zhì)的合成。因此認(rèn)為牛大力多糖具有保肝、抗炎的作用，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

牛大力多糖；保肝；抗炎

牛大力，別名山蓮藕、大力薯等。為豆科崖豆藤屬植物，美麗崖豆藤的干燥根莖。牛大力入藥歷史悠久，臨床上己證實(shí)其對(duì)諸多慢性疾病有治療作用，主治腰痛、腎虛帶下、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、慢性肝炎、病后體虛等，表明牛大力在治療肝炎、抗血管性炎癥、抗氧化等方面具有很大的潛力［1-2］。

近年來(lái)關(guān)于牛大力多糖的研究多集中在抗炎和提高免疫力等方面，如鄭元升等［3］利用小鼠急性炎癥模型證明牛大力多糖能夠明顯減輕二甲苯對(duì)小鼠耳廓造成的局部炎癥，具有較好的抗炎作用。石焱等［4］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，牛大力多糖可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，增加抗體形成細(xì)胞的數(shù)量，并能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但是關(guān)于牛大力多糖對(duì)肝臟保護(hù)與肝損傷后炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，及相關(guān)的酶表達(dá)情況的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。為了確定牛大力多糖的抗肝炎作用，特進(jìn)行了如下內(nèi)容的研究，旨在為開發(fā)該藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試動(dòng)物昆明系小鼠，SPF級(jí)，體重（20±2 g），購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2014-0011。

1.2 受試藥物牛大力多糖凍干粉［5］，由海南大學(xué)藥理學(xué)研究室提供，生藥材，購(gòu)自海南隆安源大藥堂，經(jīng)海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院王金花副教授鑒定為豆科崖豆藤屬美麗崖豆藤的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑聯(lián)苯雙酯滴丸，廣州白云山星群藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：KF40034；四氯化碳（CCl4），國(guó)產(chǎn)分析純；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、小鼠環(huán)氧化酶（COX-2）試劑盒，均為國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒。

1.4 牛大力多糖對(duì)小鼠藥物性肝損傷的保護(hù)作用

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥取SPF級(jí)KM小鼠60只，體重在20～22 g范圍內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為6組，雌雄各半。分別為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，西藥對(duì)照組，牛大力多糖高劑量（0.2 g/kg體重）、中劑量（0.1 g/kg體重）、低劑量（0.05 g/kg體重）給藥組。西藥對(duì)照組給予聯(lián)苯雙酯，給藥劑量為45mg/kg體重，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容積蒸餾水，連續(xù)給藥8 d。

1.4.2 CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型的建立各組小鼠于第4天、第8天給藥1 h后，除空白對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水外，其余各組小鼠均腹腔注射1%CCl4的油溶液10 mL/kg體重。禁食不禁水6 h后，稱量小鼠體重，摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min分離血清。同時(shí)斷頸處死小鼠，取肝臟蒸餾水沖洗血跡、稱重，并用10%甲醛溶液保存。

1.4.3 組織觀察切片制作及生化指標(biāo)檢測(cè)按肝臟重量/體重（g/100 g）測(cè)定肝臟指數(shù)。取各組小鼠肝臟制作組織切片，并觀察結(jié)果。利用小鼠ELISA試劑盒檢測(cè)血清中相關(guān)生化指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。組間差異顯著性采用單因素方差分析中的LSD方法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 牛大力總多糖對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響模型組肝臟指數(shù)極明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），肝臟明顯腫大，增長(zhǎng)比例達(dá)到13.17%，說(shuō)明急性肝損傷模型制作成功，肝損傷效果明顯；而灌胃牛大力多糖的小鼠肝臟指數(shù)較低，多糖對(duì)肝損傷引起的肝臟腫大有明顯地抑制效果（P＜0.05），抑制率高達(dá)72.18%。

2.2 肝損傷小鼠肝臟的組織切片觀察觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)中插彩版圖1），空白對(duì)照組小鼠的肝臟細(xì)胞正常，血管及周圍結(jié)構(gòu)緊密；而模型組肝組織結(jié)構(gòu)絮亂，毛細(xì)血管壁凹凸不平、斷裂，血管周圍結(jié)構(gòu)松散，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫大，甚至出現(xiàn)大量細(xì)胞破裂的情況。而給予一定劑量牛大力多糖的小鼠，可以看出毛細(xì)血管壁呈光滑，血管周圍結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞腫大較少，大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。說(shuō)明牛大力多糖對(duì)肝臟細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的完整性具有保護(hù)作用。

2.3 牛大力總多糖對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT/AST表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清中ALT/AST表達(dá)量極明顯升高（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組ALT/AST的水平極顯著降低（P＜0.01），牛大力各劑量組均能降低血清中ALT/ AST的水平；與模型對(duì)照組比較，牛大力高、中劑量能明顯降低ALT/AST水平（P＜0.05）（表2）。

表1 牛大力總多糖對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影（-X±SD，n=10）

表2 牛大力總多糖對(duì)CCl4所致急性肝損傷ALT/AST表達(dá)的影響（-X±SD，n=10）

2.4 牛大力總多糖對(duì)小鼠血清中MDA及COX-2表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組小鼠血清的MDA和COX-2表達(dá)量極明顯升高（P＜0.01）；而西藥聯(lián)苯雙酯能極顯著降低小鼠的MDA和COX-2表達(dá)水平（P＜0.01）；牛大力高、中劑量組均能明顯降低MDA水平（P＜0.05）和抑制COX-2的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)果表明，牛大力多糖能對(duì)抗CCl4所致的急性肝損傷（表3）。

表3 牛大力總多糖對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清中MDA生成和COX-2表達(dá)的影響（-X±SD，n=10）

3 小結(jié)與討論

根據(jù)目前的研究顯示，一般認(rèn)為藥物性肝炎引起的肝損傷與病毒性肝炎引起的肝損傷癥狀相似［6-7］。肝損傷早起癥狀以肝細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維膠原大量合成堆積為主［8］。肝毒性物質(zhì)能產(chǎn)生不同類型的中介物質(zhì)，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)，受損的肝細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子，細(xì)胞因子又進(jìn)而刺激炎性介質(zhì)合成的關(guān)鍵酶COX-2的表達(dá)增加，生成大量的PGs［9］，因而抗炎藥的作用往往是通過(guò)抑制COX-2實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于誘導(dǎo)物質(zhì)CCl4導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制，認(rèn)為肝細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而造成細(xì)胞器損傷［10］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，過(guò)氧化損傷肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，MDA釋放到體液中，繼而使體液中MDA大量增加［11］，進(jìn)一步加劇膜的損傷。因此，通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞及細(xì)胞膜的完整性，防止氧化應(yīng)激的發(fā)生，是抑制毒性物質(zhì)對(duì)肝臟損傷的前提和關(guān)鍵。

綜上結(jié)果說(shuō)明，牛大力多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的抑制作用主要體現(xiàn)在對(duì)肝細(xì)胞完整性的保護(hù)，防止肝細(xì)胞膜過(guò)氧化的發(fā)生以及降低COX-2的水平起抗炎作用；而維持肝細(xì)胞的完整程度又進(jìn)一步影響了細(xì)胞釋放到血清中MDA的含量及降低ALT/AST的活性，進(jìn)一步佐證了多糖對(duì)肝臟的保護(hù)能力。因此認(rèn)為牛大力多糖具有抗肝炎作用，具有較好地開發(fā)應(yīng)用前景。

［1］黃泰康，丁志遵，趙守訓(xùn).現(xiàn)代本草綱目［M］.上冊(cè)北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001：253.

［2］陳黃保.甜牛大力和苦牛大力的生藥研究［J］.中草藥，2001，32（9）：843-845.

［3］鄭元升.牛大力多糖的提取及其藥理活性研究［D］.廣州：暨南大學(xué)，2009：20（10）：2585-2587.

［4］石焱，弓小雪，那婕.牛大力多糖對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2008，36（4）：530-532.

［5］蔡紅兵，劉強(qiáng)，李慧，等.超聲提取牛大力多糖的工藝研究［J］.中藥材，2007，10：1315-1317.

［6］王建青.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急慢性肝損傷中的作用及部分機(jī)制［D］.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2012.

［7］林勝利，卓德祥，王曉紅，等.氧化損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳致大鼠肝脂肪變性中的作用機(jī)制［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006（05）：422-430.

［8］盧靜.小鼠肝損傷動(dòng)物模型的建立及在束縛應(yīng)激研究中的應(yīng)用［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［9］林力.基于花生四烯酸模型和T細(xì)胞模型的抗炎中藥篩選研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

［10］汪濤，姜華，陸國(guó)才，等.四氯化碳肝臟毒性機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.毒理學(xué)雜志，2007（04）：338-339.

［11］McAdam B F，Catella-Lawson F，Mardini IA，etal.Systemic bio?synthesis of prostacyclin by cyclooxygenase（COX）-2：the human pharmacology of a selective inhibitor of COX-2［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1999，96（1）：272-277.

Study on anti-inflammation of polysaccharide of M illettia speciosa Cham pin liver usingmousemodel

CAO Zhi-fang1，HAOHe-xuan1，YANG Yu-hui2，CHEN Tao1，JIANG Ya-lei1，WANG Jin-hua1
（1.Hainan University Agricultural College，Haikou 570228，China；2.Hainan Key Lab of reproduciton and Epidemic Disease Research，Haikou 570228，China）

To determine the liver protection and anti-inflammation of polysaccharide in Millettia speciosa Champ，we used the established acute liver injurymousemodel.The results showed thatsignificant inhibitory effect on liver injury were observed，and the inhibition ratewas upto 72.18%.The changes in tissue sections also indicated protective effectof liver.The results also showed a significantly reduction of ALT and AST activity（P＜0.01），and the formation of MDA and the expression of COX-2 were signifi?cantly suppressed.These data suggest that the polysaccharide in Millettia speciosa Champhas the potential to be used for the pro?tection of liver.

polysaccharide ofMillettia speciosa Champ；liver protection；anti-inflammation

YANG Yu-hui

R 284

A

0529-6005（2015）12-0057-03

2015-06-18

海南大學(xué)中西部計(jì)劃學(xué)科重點(diǎn)領(lǐng)域建設(shè)項(xiàng)目（ZXBJH-XK002）；海南大學(xué)教育教學(xué)研究項(xiàng)目（hdjy1531）

曹志方（1989-），男，碩士生，從事中藥開發(fā)利用的研究，E-mail：990038104@qq.com

楊雨輝，E-mail：yanguniverse@sina.com