C3a、C5a在局灶節(jié)段腎小球硬化癥小鼠發(fā)病中的作用*

任凌燕，張 穎，晏現(xiàn)麗，周雅麗，權(quán)松霞，邢國蘭

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)腎臟病研究所 鄭州 450052

C3a、C5a在局灶節(jié)段腎小球硬化癥小鼠發(fā)病中的作用*

任凌燕1,2)，張 穎1)，晏現(xiàn)麗1,2)，周雅麗1)，權(quán)松霞1)，邢國蘭1,3)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)腎臟病研究所 鄭州 450052

#通信作者，女，1964年8月生，博士，教授，研究方向：慢性腎功能衰竭的防治，E-mail：xgl@zzu.edu.cn

C3a；C5a；局灶節(jié)段腎小球硬化癥；小鼠

目的：探討C3a、C5a在局灶節(jié)段腎小球硬化癥發(fā)病中的作用。方法：雄性BALB/c小鼠分為正常對照組、野生型組、C3aR敲除組、C5aR敲除組，每組15只。野生型組、C3aR敲除組、C5aR敲除組小鼠一次性注射阿霉素(10 mg/kg)造模，正常對照組給予等體積的生理鹽水，注射阿霉素后第0、1、4、8、12周觀察小鼠一般狀況，檢測24 h尿蛋白和血清白蛋白、甘油三酯、膽固醇、肌酐。另取15只小鼠，于第4、8、12周每組處死5只小鼠，觀察腎臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果：與正常對照組比較，注射阿霉素4、8、12周后，模型小鼠24 h尿蛋白和血清甘油三酯、膽固醇、肌酐水平增加(P<0.05), 而血清白蛋白水平下降(P<0.05)；與野生型組比較，C3aR、C5aR敲除組各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善(P<0.05)。C3aR、C5aR敲除組比野生型組小鼠腎臟組織病理學(xué)改變明顯減輕。結(jié)論：C3a、C5a參與了局灶節(jié)段腎小球硬化癥的發(fā)病過程。

局灶節(jié)段腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)有研究[1-3]主要聚焦在遺傳突變、循環(huán)滲透因子、機(jī)械應(yīng)力等非免疫因素導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷與丟失。近期研究[4]顯示FSGS患者的尿液及腎組織存在補(bǔ)體激活，提示補(bǔ)體激活與FSGS發(fā)生有關(guān)。C3a、C5a是補(bǔ)體活化的關(guān)鍵致炎效應(yīng)分子。該研究應(yīng)用C3aR、C5aR基因敲除小鼠，通過建立經(jīng)典的阿霉素腎病模型，探討補(bǔ)體C3a、C5a在FSGS發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 SPF級健康雄性野生型和C3aR、C5aR基因敲除BALB/c小鼠，8～10周齡，體重25～30 g，野生型小鼠購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，C3aR、C5aR基因敲除小鼠購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。阿霉素購于北京索萊寶科技有限公司。尿蛋白、血清白蛋白(ALB)、血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、血清肌酐(Cr)檢測試劑盒購于寧波醫(yī)杰生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 適應(yīng)環(huán)境1周，自由攝食基礎(chǔ)飼料。將小鼠分為4組：正常對照組、野生型組、C3aR敲除組、C5aR敲除組，每組15只，其中野生型組、C3aR敲除組、C5aR敲除組經(jīng)尾靜脈一次性注射阿霉素10 mg/kg(用生理鹽水配制成2 g/L[5])，正常對照組注射等體積生理鹽水。

1.3 一般狀況及血、尿生化指標(biāo)測定 觀察各組小鼠注射阿霉素前后的一般狀況，于注射阿霉素前及注射阿霉素1、4、8、12周后用代謝籠收集24 h尿液，測定24 h尿蛋白水平；通過小鼠內(nèi)眥靜脈取血，全自動(dòng)生化分析儀測定血清ALB、TG、TC和Cr水平。

1.4 腎臟組織病理學(xué)改變 60只小鼠分組同1.2。于注射阿霉素4、8、12周后每組各處死5只小鼠,用體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定腎組織，常規(guī)石蠟包埋，2 μm厚切片, 過碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)染色、馬松三色(MASSON)染色,觀察腎臟組織病理學(xué)變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較4組小鼠24 h尿蛋白和血清ALB、TC、TG、Cr水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況的比較 正常對照組小鼠正常活動(dòng)，正常飲食。而注射阿霉素1周后模型小鼠精神欠佳,進(jìn)食、活動(dòng)量減少,被毛直立，毛不順滑，4周后所有小鼠均恢復(fù)正常，飲食、活動(dòng)量增加。12周內(nèi)野生型組小鼠有5只死亡；C3aR敲除組有1只死亡。

2.2 各組小鼠24 h尿蛋白水平的比較 與正常對照組比較，注射阿霉素1周后，模型小鼠24 h尿蛋白水平顯著增加，達(dá)到高峰，大量蛋白尿一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)第12周；與野生型組比較，C3aR敲除組、C5aR敲除組尿蛋白水平顯著下降。見表1。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白水平比較 mg/24 h

F組間=41.868，P<0.001；F時(shí)間=240.732，P<0.001；F交互=13.272，P<0.001；*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與野生型組比較，P<0.05。

2.3 各組小鼠血清ALB、TC、TG和Cr水平的比較 見表2～5。與正常對照組小鼠比較，注射阿霉素后模型小鼠血清ALB水平降低，1周后降至最低，4周后有所回升；與野生型組比較，C3aR敲除組、C5aR敲除組降低程度明顯減輕。 與正常對照組比較，模型小鼠血清TG和TC水平顯著增加；與野生型組比較，C3aR敲除組、C5aR敲除組增加程度明顯減輕。與正常對照組比較，注射阿霉素4周后模型小鼠血清Cr水平顯著增加；與野生型組比較，注射阿霉素8周后C3aR敲除組、C5aR敲除組血清Cr水平增加程度明顯減輕。

2.4 腎臟病理改變 野生型組第4周可見部分腎小球出現(xiàn)局灶、節(jié)段硬化，伴有足細(xì)胞腫脹，腎小管有較多蛋白管型，腎間質(zhì)變化不明顯；第8周部分腎小球出現(xiàn)球性硬化，伴有明顯的足細(xì)胞增生和肥大，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，可見大量蛋白管型，腎間質(zhì)可見輕度纖維化；第12周彌漫性腎小球出現(xiàn)球性硬化，足細(xì)胞明顯增生和肥大，部分腎小管萎縮、片狀擴(kuò)張，腎間質(zhì)小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄，間質(zhì)內(nèi)可見灶狀淋巴細(xì)胞浸潤和輕度纖維化。C3aR敲除組、C5aR敲除組第4、8、12周偶見部分腎小球出現(xiàn)系膜基質(zhì)輕、中度增生，球囊粘連，呈現(xiàn)節(jié)段性輕、中度硬化，腎小管少量蛋白管型，腎間質(zhì)未見明顯病變。見圖1、2。

表2 各組小鼠血清ALB水平的比較 g/L

F組間=71.326，P<0.001；F時(shí)間=516.152，P<0.001；F交互=17.074，P<0.001；*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與野生型組比較，P<0.05。

表3 各組小鼠血清TC水平的比較 mmol/L

F組間=81.891，P<0.001；F時(shí)間=484.972，P<0.001；F交互=8.761，P<0.001；*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與野生型組比較，P<0.05。

表4 各組小鼠血清TG水平的比較 mmol/L

F組間=65.070，P<0.001；F時(shí)間=595.738，P<0.001；F交互=21.860，P<0.001；*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與野生型組比較，P<0.05。

表5 各組小鼠血清Cr水平的比較 mmol/L

F組間=38.531，P<0.001；F時(shí)間=106.631，P<0.001；F交互=17.763，P<0.001；*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與野生型組比較，P<0.05。

圖1 4組小鼠腎臟病理改變(PAS，×200)

圖2 4組小鼠腎臟病理改變(MASSON，×200)

3 討論

近年研究[4]提示補(bǔ)體激活可能參與了FSGS 的發(fā)生和發(fā)展。C1q腎病89.5%病理表現(xiàn)為FSGS，提示補(bǔ)體活化與FSGS 密切相關(guān)，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的異常參與FSGS 發(fā)病。有學(xué)者[6]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體激活抑制因子缺失會(huì)加速FSGS的發(fā)展。補(bǔ)體三條激活途徑具有共同的末端通路，即產(chǎn)生過敏毒素C3a、C5a，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)以及形成膜攻擊復(fù)合物(C5b-9)導(dǎo)致細(xì)胞溶解效應(yīng)。C3a、C5a 是補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的最主要的致炎產(chǎn)物，與特異性受體C3aR、C5aR 結(jié)合后，通過趨化、促炎癥介質(zhì)釋放、促細(xì)胞黏附等作用，參與了過敏、感染及自身免疫疾病等多種炎癥性疾病的發(fā)病過程。抑制C3a、C5a 相應(yīng)受體可以減輕炎癥反應(yīng)和組織損傷。在既往的研究[7]中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者尿液C3活化產(chǎn)物水平顯著升高，而尿液C5b-9 水平與其他腎臟病患者無明顯差別，提示C3a、C5a 可能是FSGS 中補(bǔ)體損傷的主要效應(yīng)因子。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)C3a、C5a 參與多種腎臟疾病的發(fā)病過程。拮抗或敲除C3aR、C5aR可能延緩疾病進(jìn)展[10]。

Tang等[11]利用阿霉素誘導(dǎo)腎病模型后發(fā)現(xiàn)C3a 參與腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化，C3aR基因敲除可改善腎功能。阿霉素進(jìn)展性腎病已經(jīng)成為經(jīng)典的局灶節(jié)段腎小球硬化模型，以大量蛋白尿、進(jìn)行性腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化為主要特征。該研究利用對腎毒性比較敏感的野生型、C3aR基因敲除、C5aR基因敲除Balb/c小鼠[12]，一次性經(jīng)尾靜脈注射阿霉素(10 mg/kg)造模。注射阿霉素4、8、12周后，野生型組小鼠24 h尿蛋白定量和血清TC、TG、Cr水平均顯著高于其他3組，血清ALB顯著低于其他3組。野生型組第4周可見部分腎小球出現(xiàn)局灶、節(jié)段硬化，腎小管有較多蛋白管型，腎間質(zhì)變化不明顯；第8周部分腎小球出現(xiàn)球性硬化，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，可見大量蛋白管型，腎間質(zhì)可見纖維化；第12周彌漫性腎小球出現(xiàn)球性硬化，部分腎小管萎縮、片狀擴(kuò)張，腎間質(zhì)小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄，間質(zhì)內(nèi)少量纖維化。C3aR敲除組、C5aR敲除組第4、8、12周偶見部分腎小球呈現(xiàn)節(jié)段性輕、中度硬化，腎小管少量蛋白管型，腎間質(zhì)未見明顯病變，與野生型組比較，腎臟病理改變較輕。12周內(nèi)野生型組小鼠死亡5只，C3aR敲除組死亡1只，C5aR敲除組及正常對照組無小鼠死亡。由此可見，C3aR敲除、C5aR敲除可明顯改善腎臟功能，減輕腎臟病理改變。

綜上所述，C3a、C5a參與了FSGS的發(fā)病過程，但具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(2014-12-07 收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Roles of C3a and C5a in pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis in mice

RENLingyan1,2),ZHANGYing1),YANXianli1,2),ZHOUYali1),QUANSongxia1),XINGGuolan1,3)

1)DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince，Zhengzhou450052 3)InstituteofNephrology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

C3a;C5a;focal segmental glomerulosclerosis;mouse

Aim: To investigate the roles of C3a,C5a in the pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis.Methods: Male Balb/c were divided into four groups: normal control group,wild-type group,C3aR knockout group and C5aR knockout group, and each group had 15 mice.Wild-type group, C3aR knockout group, and C5aR knockout group were given adriamycin at 10 mg/kg by a single tail intravenous injection,and the normal control group was given the same amount of normal saline.To compare their general condition,the levels of 24 hour urinary protein, serum albumin,serum triglyceride,serum cholesterol,and serum creatinine at 0,1st,4th,8th,and 12th week after injection were detected.Five mice was sacrificed at the 4th,8th,and 12th to observe the pathology changes of kidney.Results: After being injected adriamycin for 1,4,8,and 12 weeks,the levels of 24 hour urinary protein,serum triglyceride,serum cholesterol,and serum creatinine went up significantly(P<0.05),while serum albumin decreased significantly(P<0.05).Compared with the C3aR knockout and C5aR knockout groups,the changes of the above indicators were more significant in the wild-type group(P<0.05). Compared with the wild-type group,the C3aR knockout and C5aR knockout groups had milder pathological changes in kidney.Conclusion: C3a and C5a may take part in the pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.008

*國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目 8140040515

R692.9