利用異源酵母功能互補(bǔ)法研究水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)體OsAMT1；1功能及調(diào)控機(jī)制

楊順瑛　叢郁　郝東利　等

摘要：水稻是一種以銨態(tài)氮為主要氮素營(yíng)養(yǎng)的重要糧食作物，存在至少12個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)體，對(duì)水稻銨的吸收起著至關(guān)重要的作用，其中，水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)體1；1（Oryza sativa ammonium transporter1；1，OsAMT1；1）是一個(gè)在根部和地上部相對(duì)組成型表達(dá)的基因。通過(guò)異源酵母功能互補(bǔ)法研究水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)體OsAMT1；1的功能及其調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明，OsAMT1；1是一個(gè)功能型的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體，和銨的同系物甲基銨（Methylammonium，MeA+）相比，OsAMT1；1對(duì)銨具有相對(duì)較高的選擇性；OsAMT1；1介導(dǎo)銨的吸收不依賴于外界質(zhì)子，轉(zhuǎn)運(yùn)的底物可能是銨離子；OsAMT1；1介導(dǎo)吸收銨的過(guò)程是一個(gè)依賴能量的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程，對(duì)銨的吸收可能不受鈣離子參與的磷酸化過(guò)程調(diào)控。

關(guān)鍵詞：水稻；銨轉(zhuǎn)運(yùn)體1；1；酵母功能互補(bǔ)；調(diào)控

中圖分類號(hào)： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0027-04

收稿日期：2014-04-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃（編號(hào)：91125028）。

作者簡(jiǎn)介：楊順瑛（1982—），女，湖北恩施人，博士，主要從事分子植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究。Tel：（025）86881553；E-mail：ysy@issas.ac.cn。

通信作者：蘇彥華，山東濟(jì)寧人，博士，教授、研究員，從事植物營(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)研究。E-mail：yhsu@issas.ac.cn。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，生長(zhǎng)在淹水條件下，以銨為主要氮源[1]。銨轉(zhuǎn)運(yùn)體（ammonium transporter，AMT）家族基因編碼的銨轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，是水稻銨吸收和代謝的重要途徑[1-2]。水稻中至少存在12個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，分為兩大家族，OsAMT1；1-1；3歸屬于AMT1家族，其余9個(gè)基因包括OsAMT2；1-2；3、OsAMT3；1-3；3、OsAMT4、OsAMT5；1-5；2歸屬于AMT2家族[3]，其中，有關(guān)水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)體1；1（Oryza sativa ammonium transporter1；1，OsAMT1；1）基因的表達(dá)規(guī)律及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的研究取得一定進(jìn)展。 OsAMT1；1在根部和地上部更傾向于組成型表達(dá)，可能負(fù)責(zé)根部從外界吸收銨[2]；過(guò)表達(dá)研究表明，OsAMT1；1能夠增強(qiáng)銨的吸收和體內(nèi)的銨含量[4]；和野生型相比，在銨次優(yōu)和最優(yōu)條件下，OsAMT1；1表達(dá)水平高于野生型20多倍，銨吸收速率明顯高于野生型，同時(shí)，體內(nèi)高銨含量也促進(jìn)氮同化途徑基因的表達(dá)，使體內(nèi)氮同化產(chǎn)物、葉綠素、淀粉、糖類及產(chǎn)量都有較大提高，暗示OsAMT1；1有提高氮利用效率、植物生長(zhǎng)及糧食產(chǎn)量的潛力[1]。然而，對(duì)OsAMT1；1銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展不大。 本試驗(yàn)采用酵母功能互補(bǔ)方法，初步研究不同外界pH值、銨的同系物甲基銨（methylammonium，MeA+）、羰基氰化間氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）及離子鈣（Ca2+）的螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸[ethyleneglycol-bis（beta-aminoethylether）-N，N′-tetraacetic acid，EGTA]等處理?xiàng)l件對(duì)OsAMT1；1的調(diào)控機(jī)制，以期為進(jìn)一步解析OsAMT1；1在水稻銨代謝中的功能提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用大腸桿菌菌株為Escherichia coli DH5α，中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所實(shí)驗(yàn)室保存；所用表達(dá)宿主菌株為釀酒酵母銨轉(zhuǎn)運(yùn)體缺失突變體31019b（mep1Δ，mep2Δ：：LEU2，mep3Δ：：KanMX2 ura3），由德國(guó)Hohenheim大學(xué)Nico Von Wirén教授惠贈(zèng)，在外界銨作為唯一氮源且濃度低于5 mmol/L時(shí)，此菌株不能正常生長(zhǎng)[5]；酵母表達(dá)載體pYES2，購(gòu)于 Invitrogen 公司；YNB培養(yǎng)基，不含硫酸銨和氨基酸（yeast nitrogen base w/o ammonium sulfate and amino acids），購(gòu)于Difco公司；D-半乳糖、精氨酸、氯化銨和甲基胺（methylammonium，MeA+），購(gòu)于Sigma公司；PCR擴(kuò)增高保真酶PrimeSTAR，購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ，購(gòu)于New England Biolabs公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2酵母表達(dá)載體OsAMT1；1-pYES2的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[3]中OsAMT1；1 ID號(hào)，從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TIGR （http：//rice.plantbiology.msu.edu/）檢索OsAMT1；1的cDNA序列，大小為1 497 bp。設(shè)計(jì)引物OsAMT1；1-KpnⅠ-P1：5′-GTCGGTACCATGGCGACGTGCGCGGCGGACCTG-3′和OsAMT1；1-NotⅠ-P2：5′-GTCGCGGCCGCTTACACTTGGTTGTTGCTGTTGG-3′，以粳稻日本晴（Oryza sativa. ssp. Japonic Nipponbare） cDNA為模板，擴(kuò)增OsAMT1；1基因。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)處理5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用MN （MACHEREY-NAGEL）膠回收試劑回收，利用常規(guī)rTaq酶在無(wú)引物PCR反應(yīng)體系中72 ℃反應(yīng)20 min，將產(chǎn)物的3′端加上堿基A，然后連接到pMD18-T vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技有限公司上海分公司測(cè)序。用限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ，分別酶切測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆和酵母表達(dá)載體pYES2，回收并用T4 DNA連接酶連接目的片段和載體大片段，轉(zhuǎn)化DH5α，篩選鑒定并獲得OsAMT1；1-pYES2 陽(yáng)性克隆。

1.3酵母培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)化儀Micro Pulser（Bio-Rad公司），將OsAMT1；1-pYES2和空載體pYES2分別轉(zhuǎn)入酵母銨轉(zhuǎn)運(yùn)體缺失突變菌株31019b感受態(tài)細(xì)胞，電擊后加入1 mL預(yù)冷的 1 mol/L 山梨醇，30 ℃度溫育2 h，于酵母選擇性培養(yǎng)基（017% YNB+2 mmol/L精氨酸+2% D-半乳糖+2%瓊脂）平板上30 ℃黑暗培養(yǎng)3 d；挑取單菌落在酵母液體選擇培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)36 h，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的單菌落即為重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019 b。重組酵母菌株在YNB液體選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)至D600 nm為1.0，經(jīng)10倍梯度稀釋成10-1、10-2、10-3 3個(gè)濃度，分別取4個(gè)濃度梯度的菌液5 μL，點(diǎn)樣于以2 mmol/L精氨酸，或pH 值為5.8、不同濃度NH4Cl為唯一氮源，或2 mmol/L NH4Cl 為唯一氮源，pH值分別為4.8、5.8、6.8和不同處理試劑（EGTA，MeA+或CCCP）的固體培養(yǎng)基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2%瓊脂）上，于30 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)狀況并適時(shí)拍照。 所有處理均以轉(zhuǎn)空載體pYES2的31019b酵母pYES2/31019b為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1OsAMT1；1-pYES2載體構(gòu)建

以水稻Nipponbare cDNA為模板，以O(shè)sAMT1；1-KpnⅠ-P1 和OsAMT1；1-NotⅠ-P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1 497 bp的產(chǎn)物（圖1-a）；純化并連接pMD18-T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和測(cè)序獲得陽(yáng)性克隆OsAMT1；1-pMD18-T；用KpnⅠ和NotⅠ分別酶切質(zhì)粒OsAMT1；1-pMD18-T和pYES2，膠回收獲得線性目的片段OsAMT1；1和pYES2載體大片段，用T4 DNA 連接酶連接目的片段和載體大片段，16 h 后經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選鑒定，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒OsAMT1；1-pYES2，其酶切驗(yàn)證圖譜見(jiàn)圖1-b，OsAMT1；1-pYES2質(zhì)粒構(gòu)成見(jiàn)圖 1-c。將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至31019b酵母感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性重組菌株用于本研究。

2.2OsAMT1；1的酵母功能互補(bǔ)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，在以2 mmol/L 精氨酸為唯一氮源的固體培養(yǎng)基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2 mmol/L精氨酸+2%瓊脂）上，轉(zhuǎn)化了OsAMT1；1-pYES2和空載體pYES2的菌株都能正常生長(zhǎng)（圖2-a）；在以0.02、0.2、2 mmol/L NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+不同濃度的銨+2%瓊脂）上，轉(zhuǎn)化空載體的酵母pYES2/31019b不能正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化了OsAMT1；1-pYES2的重組酵母能夠正常生長(zhǎng)（圖2-b），并隨銨濃度不斷升高，重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b生長(zhǎng)得越好。這說(shuō)明OsAMT1；1具有吸收銨的功能，能夠介導(dǎo)銨的吸收。

2.3甲基銨對(duì)OsAMT1；1吸收銨功能的影響

甲基銨是銨的有機(jī)同系物，通常作為銨的競(jìng)爭(zhēng)吸收底物而用于研究銨轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能[6-7]。由圖3可見(jiàn)，在017%

YNB、2% D-半乳糖和25 mmol/L MeA+固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h或96 h，轉(zhuǎn)化了OsAMT1；1的酵母菌株能夠生長(zhǎng)，而照菌株生長(zhǎng)極其微弱，甚至觀察不到生長(zhǎng)跡象，這表明OsAMT1；1能夠吸收甲基銨，并以其為氮源促進(jìn)31019b的生長(zhǎng)；在017% YNB、2% D-半乳糖和100 mmol/L MeA+固體培養(yǎng)基條件下，轉(zhuǎn)化了OsAMT1；1的酵母菌株可能吸收過(guò)多的甲基銨而致死；在銨和甲基銨共存時(shí)（0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH+4添加25 mmol/L或100 mmol/L MeA+），轉(zhuǎn)化了OsAMT1；1的酵母菌株生長(zhǎng)恢復(fù)正常，這些均表明OsAMT1；1也能夠介導(dǎo)吸收甲基銨，在銨和甲基銨共存時(shí)，OsAMT1；1會(huì)優(yōu)先吸收銨，對(duì)銨具有較高選擇性。

2.4外界pH 值對(duì)OsAMT1；1功能的影響

在2 mmol/L NH+4作為唯一氮源、pH值分別為4.8、5.8、6.8）的固體培養(yǎng)基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2 mmol/L銨+2%瓊脂）上，轉(zhuǎn)化空載體的酵母pYES2/31019b不能正常生長(zhǎng)，重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b生長(zhǎng)良好（圖4）。這說(shuō)明OsAMT1；1轉(zhuǎn)運(yùn)銨的能力可能與外界質(zhì)子無(wú)關(guān)，對(duì)銨的吸收可能不受外界質(zhì)子的調(diào)控，并且OsAMT1；1轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)銨的底物是離子態(tài)銨。

2.5CCCP對(duì)OsAMT1；1功能的影響

羰基氰化間氯苯腙（CCCP）是一種解偶聯(lián)劑[8]，最早用于研究線粒體和葉綠體的氧化磷酸化解偶聯(lián)過(guò)程[9]。在含0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH4Cl固體培養(yǎng)基中添加100 μmol/L CCCP時(shí)，轉(zhuǎn)化了OsAMT1；1的酵母和對(duì)照菌株幾乎都觀察不到生長(zhǎng)跡象（圖5），CCCP強(qiáng)烈抑制OsAMT1；1對(duì)銨的吸收，OsAMT1；1的吸銨過(guò)程可能是一個(gè)依賴能量的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程。

2.6EGTA對(duì)OsAMT1；1功能的影響

乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）是一種鈣離子螯合劑，在含0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH4Cl固體培養(yǎng)基中添加 1 mmol/L EGTA 時(shí)培養(yǎng)48、96 h， 重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b能夠正常生長(zhǎng)，和未添加EGTA的YNB 培養(yǎng)基上幾乎沒(méi)有差別（圖6）， OsAMT1；1對(duì)銨的吸收可能不受Ca2+參與的磷酸化過(guò)程調(diào)控。

3結(jié)論與討論

植物從土壤環(huán)境中吸收銨主要由高親和與低親和的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)，在銨濃度大于1 mmol/L時(shí)，一般認(rèn)為，主要通過(guò)離子通道調(diào)控銨的內(nèi)流[10-12]；當(dāng)外界銨濃度小于1 mmol/L時(shí)，主要是通過(guò)高親和銨轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)銨的吸收[13-14]。在通氣良好的農(nóng)業(yè)土壤中，硝酸鹽是主要的無(wú)機(jī)氮形式，植物吸收的硝酸大于銨，相反，在通氣不良的農(nóng)業(yè)土壤尤其是水田，銨是主要的無(wú)機(jī)氮形式。 水稻是一種喜銨和耐銨的作物[15-16]，在整個(gè)生育期幾乎全部以銨態(tài)氮為營(yíng)養(yǎng)[2]。OsAMT1；1能夠介導(dǎo)銨的吸收，是一個(gè)功能型的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體，在外界銨為唯一氮源的條件下，能夠互補(bǔ)銨轉(zhuǎn)運(yùn)體缺失突變體酵母菌株31019b的生長(zhǎng)[2]，并隨外界銨濃度的升高，重組菌株OsAMT1；1-pYES2/31019b 的生長(zhǎng)越好。在外界銨濃度變化的情況下，OsAMT1；1對(duì)銨的吸收起著非常重要的作用。

長(zhǎng)期以來(lái)，植物AMT吸收轉(zhuǎn)運(yùn)銨是以分子態(tài)NH3還是離子態(tài)銨一直是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。在外界不同pH 值條件下，重組菌株OsAMT1；1-pYES2/31019b的生長(zhǎng)狀況幾乎沒(méi)有差別，OsAMT1；1轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白對(duì)銨的吸收不受外界質(zhì)子的調(diào)控，轉(zhuǎn)運(yùn)的底物是銨離子而非分子態(tài)NH3，和PcAMT1-1類似[17]，可能都是不受外界質(zhì)子調(diào)控的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體。電生理手段證明，當(dāng)外界pH從酸性值變化為堿性時(shí)，銨轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的電流大小和方向幾乎沒(méi)有改變，這與擬南芥AtAMT1；1、番茄LeAMT1；1轉(zhuǎn)運(yùn)銨不依賴于外界質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制結(jié)論[13，18]吻合。對(duì)于OsAMT1；1的詳盡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，需要進(jìn)一步用電生理手段完善。

高親和的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)銨的內(nèi)流通常依賴于代謝能量，解偶聯(lián)劑CCCP能夠使高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)銨的內(nèi)流下降81%～87%[19]。在銨作為唯一氮源的YNB選擇性培養(yǎng)基中添加100 μmol/L CCCP，幾乎觀察不到重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b的生長(zhǎng)，OsAMT1；1對(duì)銨的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)依賴能量的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程。

鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育的一種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，植物體內(nèi)CBL（Calcineurin B-like Protein）被鈣離子活化后，能激活 CIPK（CBL-Interacting Protein Kinase）基因蛋白來(lái)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫信號(hào)[20-21]。擬南芥鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體AKT1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性受CIPK23磷酸化調(diào)控，CIPK23受上游CBL1和CBL9激活，從而增強(qiáng)植物在外界低鉀條件下對(duì)鉀素的吸收[20]。本研究初步探索鈣對(duì)OsAMT1；1的調(diào)控特征，OsAMT1；1-pYES2/31019b在施加鈣的螯合劑EGTA 1 mmol/L 的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48、96 h，與未加EGTA的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有差別，OsAMT1；1對(duì)銨的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)可能不受鈣信號(hào)參與的磷酸化過(guò)程調(diào)控，其調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

甲基銨是銨的有機(jī)同系物，通常作為銨的吸收底物或競(jìng)爭(zhēng)吸收底物研究銨轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能特征[6-7，13]，人紅血細(xì)胞中的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體同族體RHCG能夠介導(dǎo)甲基銨的電中性轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)甲基銨的吸收速率隨外界pH值增加而增加[7]。本研究中，當(dāng)以 25 mmol/L 甲基銨為唯一氮源時(shí)，重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b能夠生長(zhǎng)，而對(duì)照菌株pYES2/31019b不能生長(zhǎng)，這表明OsAMT1；1能夠介導(dǎo)甲基銨的吸收；當(dāng)外界甲基銨濃度為100 mmol/L時(shí)，重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，可能是吸收甲基銨過(guò)量而致死。當(dāng)在25 mmol/L或 100 mmol/L 甲基銨條件下補(bǔ)充2 mmol/L NH+4時(shí)，重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b的生長(zhǎng)恢復(fù)正常，表明在銨和甲基銨共存的條件下，OsAMT1；1會(huì)優(yōu)先、更多地吸收轉(zhuǎn)運(yùn)銨，對(duì)銨具有較高的選擇性，這也表明OsAMT1；1在對(duì)水稻銨營(yíng)養(yǎng)吸收方面具有至關(guān)重要的作用。

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