腫瘤循環(huán)線粒體DNA研究現(xiàn)狀

金濤辛毅娟

腫瘤循環(huán)線粒體DNA研究現(xiàn)狀

金濤1辛毅娟2★

近年來日益增多的研究表明，腫瘤在生長過程中會持續(xù)釋放腫瘤細(xì)胞DNA進入外周血液。釋放的DNA根據(jù)核基因和核外基因分為循環(huán)核DNA（nuclear acid， nDNA）和循環(huán)線粒體DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）。目前，幾乎所有研究都集中于循環(huán)nDNA，循環(huán)mtDNA鮮有關(guān)注。為此，我們從定性和定量兩個方面，對國際上已報道的關(guān)于循環(huán)mtDNA方面的研究進行歸類綜述，初步探討循環(huán)mtDNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義進行，闡明循環(huán)mtDNA在腫瘤診斷以及療效監(jiān)測中潛在的臨床應(yīng)用價值。

腫瘤；循環(huán)線粒體DNA；突變；拷貝數(shù)

［KEY WORDS］Tumor；Circulating mitochondrial DNA；Mutation；Copy number

1977年Leon等［1］首先發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿循環(huán)DNA濃度明顯高于非腫瘤患者，且腫瘤轉(zhuǎn)移患者傾向于含有更高水平的血漿循環(huán)DNA。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是熒光定量PCR技術(shù)的建立，研究者［2-8］陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這些DNA不僅在量上與腫瘤相關(guān)，而且在質(zhì)上也具有腫瘤DNA的特點，如具有類似腫瘤的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，這些改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在很大關(guān)系。上述發(fā)現(xiàn)顯示出循環(huán)DNA檢測在腫瘤的早期診斷、鑒別、預(yù)后評估方面的重要意義。

目前循環(huán)DNA的報道都集中在腫瘤患者血漿中的循環(huán)nDNA（nuclear acid，nDNA），但是值得指出的是血漿中還有 nDNA外的 mtDNA （mitochondrial DNA，mtDNA）。相比于nDNA，在拷貝數(shù)定量方面，mtDNA具有更多的拷貝數(shù)，每個細(xì)胞可達上百甚至上千個的拷貝，因此相對于nDNA更容易檢測。在突變位點定性檢測方面，已有大量的研究［9］表明許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與mtDNA的突變存在很大的相關(guān)性，mtDNA的突變在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，某些mtDNA位點的突變會進一步促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，mtDNA可以作為潛在的一個臨床腫瘤診斷指標(biāo)。與循環(huán)nDNA通過細(xì)胞壞死，凋亡釋放入血的途徑有所不同，有研究［10］顯示活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多、功能發(fā)生紊亂的線粒體可以通過主動外排的形式釋放mtDNA。另一研究［11］則提示在細(xì)胞凋亡途徑受阻時，線粒體中的mtDNA會被選擇性的降解。最近，Nakahira等［12］則發(fā)現(xiàn)ROS生成增多的線粒體會導(dǎo)致線粒體膜通道的滲透性改變，mtDNA會在炎癥因子的介導(dǎo)下從線粒體中釋放出來。綜上可知，在氧化壓力升高、線粒體功能發(fā)生紊亂的情況下，細(xì)胞中mtDNA會排放到細(xì)胞外。因此，胞外血漿中mtDNA的變化，相對于nDNA的釋放是不是一種更靈敏的監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個指標(biāo)值得進一步研究證實。

對循環(huán)腫瘤DNA的檢測可分為定性和定量2種：前者主要指檢測血清和血漿中腫瘤特異性基因的改變，后者則檢測血清和血漿的DNA拷貝數(shù)，兩者均可從不同程度反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度?，F(xiàn)綜述目前為止腫瘤循環(huán)mtDNA的相關(guān)研究。

1 血漿中循環(huán)mtDNA的定性研究

血漿中循環(huán)mtDNA突變的報道最先出現(xiàn)在糖尿病研究中。mtDNA3243位點A到G突變是較常見的mtDNA突變位點之一。到目前為止，已經(jīng)在諸多線粒體疾病中［13-18］檢測到該突變。而且，mtDNA3243 A到G突變已證實與糖尿病的一個支系——線粒體母系遺傳的Ⅱ型糖尿病的發(fā)生有很大的相關(guān)性［19-20］。Zhong等［21］對16例Ⅱ型糖尿病患者和25例正常對照的淋巴細(xì)胞、血漿及血清mtDNA 3243位點進行篩查后發(fā)現(xiàn)，在正常人的血漿及血清中沒有檢測到3243位點A-G突變，在3243位點沒有發(fā)生A-G突變的糖尿病患者淋巴細(xì)胞中，其血漿和血清中也沒檢測到相應(yīng)的突變，而在7例淋巴細(xì)胞發(fā)生3243A-G突變的糖尿病患者中，其血漿和血清中也相應(yīng)的檢測到3243A-G突變，相應(yīng)的檢測率達到100%，而且在血漿血清中mtDNA突變的異質(zhì)性水平高于淋巴細(xì)胞。該研究提示血漿相對于血液中的淋巴細(xì)胞更能反映3243位點的突變情況，血漿中突變的檢測可以作為一種新的切入點。

隨后，在前列腺癌的相關(guān)研究中［22］，研究者檢測到16例前列腺癌組織標(biāo)本中存在3例mtDNA突變，在這3例病人對應(yīng)的血清及尿液標(biāo)本中均檢測到與組織相同的突變，突變水平相比于細(xì)胞有所降低，但是在血液淋巴細(xì)胞中并沒有檢測到相應(yīng)的mtDNA突變，提示血漿中的mtDNA有部分來源于腫瘤組織，而且血漿和血液淋巴細(xì)胞可能代表不同的生物學(xué)意義，具有不同的臨床診斷價值。同時，又有研究人員［23］運用熒光定量的方法發(fā)現(xiàn)77例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中有7例存在mtDNA D-loop區(qū)突變。在這7例標(biāo)本對應(yīng)的血清樣本中，檢測到1例血漿樣本存在與組織相應(yīng)的D-loop區(qū)71-G缺失突變。同樣的方法，研究者［24］在50例肝癌病人組織標(biāo)本中也檢測到15例病人存在mtDNA的突變，在這15例病人對應(yīng)的血清標(biāo)本中檢測到7例病人存在與組織相同的突變。雖然運用同樣的方法，結(jié)直腸癌和肝癌中突變檢出率卻并不相同，原因可能是癌種的不同、癌癥分期的不同以及DNA提取方法的不同等。研究指出血漿中突變的mtDNA被正常的循環(huán)mtDNA大大稀釋；其次，線粒體中mtDNA突變具有異質(zhì)性的特點，即一個細(xì)胞內(nèi)同時存在突變的和野生型的mtDNA，導(dǎo)致mtDNA突變的水平往往較低。因此盡管僅檢出相應(yīng)的1例突變，但并不意味著血漿中不存在相應(yīng)的突變mtDNA。血漿循環(huán)DNA中低拷貝的突變DNA對檢測手段提出了更高要求，但是隨著更加精確和靈敏的檢測手段的出現(xiàn)，循環(huán)DNA中突變的DNA的檢測將不再是一個技術(shù)難題。

2 血漿中循環(huán)mtDNA的定量研究

Chiu等［25］運用熒光定量 PCR的方法對正常人血漿中的mtDNA的拷貝數(shù)進行了定量，結(jié)果顯示熒光定量PCR具有足夠的靈敏度檢測正常人血漿中少至一個拷貝的微量mtDNA。該研究發(fā)現(xiàn)，血漿中mtDNA主要以游離的形式和顆粒結(jié)合的形式存在，這2種存在形式的來源機理及其生物學(xué)意義是否相同尚未清楚。為了分離2種不同形式的mtDNA，研究者采用了四種不同的血漿處理方式。對比研究后發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過高速離心或0.2 μm膜過濾處理，血漿中游離形式的mtDNA和顆粒結(jié)合形式的mtDNA的量有顯著地變化，其可能原因是一步離心（1 600 g，10 min）不能有效清除血漿中殘留的細(xì)胞，每個細(xì)胞中含有幾千個線粒體，未除盡的細(xì)胞將極大地影響最后的定量結(jié)果。研究進一步發(fā)現(xiàn)，盡管經(jīng)過了兩步離心（1 600 g，10 min；16 000 g再10 min），其效果和未經(jīng)第二步離心而改用0.2 μm膜過濾的相比也存在差異，提示血漿中循環(huán)mtDNA存在較多的非游離的顆粒型mtDNA。進一步，研究者在兩步離心的基礎(chǔ)上加上第三步，即0.2 μm膜過濾或超高速離心后發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)第三步處理的血漿循環(huán)mtDNA的量顯著升高，證實了血漿中循環(huán)mtDNA存在游離型和顆粒結(jié)合性兩種形式，文章指出顆粒型的mtDNA可能來源于線粒體（直徑0.5～1 μm，長度5～10 μm）和血小板（每個含四個拷貝的mtDNA）。該研究成果在今后循環(huán)mtDNA血漿處理方法的選擇上具有很好的借鑒意義，循環(huán)mtDNA可能有兩種存在形式，即游離型的和顆粒結(jié)合型的，至于以哪種存在形式為主，哪種存在形式和疾病發(fā)生相關(guān)需要進一步的研究。

在104例3種常見卵巢疾?。殉舶?、卵巢上皮腫瘤和子宮內(nèi)膜異位）樣本中［26］，研究者發(fā)現(xiàn)21例卵巢癌患者血漿中循環(huán)nDNA和mtDNA均顯著高于36例正常對照和24例卵巢上皮腫瘤患者，存在統(tǒng)計學(xué)差異。卵巢癌血漿中循環(huán)mtDNA也顯著高于23例子宮內(nèi)膜異位組，但循環(huán)nDNA在兩組之間不存在顯著差異，而且血漿中循環(huán)nDNA和循環(huán)mtDNA不存在一一對應(yīng)的關(guān)系，提示血漿中循環(huán)nDNA和mtDNA可能存在不同的釋放機理，代表不同的生物學(xué)意義。

而在晚期前列腺癌中，研究者發(fā)現(xiàn)，相比于仍存活的病人，80%術(shù)后僅有兩年存活期的前列腺癌病人的血漿循環(huán)mtDNA顯著升高［27］。文章指出循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)的升高和腫瘤細(xì)胞的增多、腫瘤旁正常組織蛋白酶活性增強存在相關(guān)性。通過上述對預(yù)后病人生存期的隨訪和血漿循環(huán)mtDNA 和mtRNA的研究，結(jié)果提示在前列腺癌診斷和預(yù)后評估方面，血漿中循環(huán)mtDNA和mtRNA相對于循環(huán)nDNA具有更高的靈敏度和特異性，并有望成為前列腺癌術(shù)后評估的一個新的參考指標(biāo)。與上述前列腺癌的研究結(jié)果不同，Kohler等［28］在乳腺腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然血漿中循環(huán)nDNA 在52例乳腺惡性腫瘤組和26例乳腺良性腫瘤組顯著高于70例正常對照組，但是血漿中循環(huán)mtDNA在惡性腫瘤和良性腫瘤組均顯著低于正常對照組。文章認(rèn)為，在腫瘤細(xì)胞中mtDNA暴露于ROS下，控制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的D-loop區(qū)容易發(fā)生突變，該區(qū)突變的發(fā)生會導(dǎo)致mtDNA的復(fù)制速率的下降，最終導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)的降低。而良性腫瘤組中循環(huán)mtDNA低于惡性腫瘤組，是由于在癌細(xì)胞中mtDNA突變導(dǎo)致細(xì)胞整體的呼吸水平的下降，進而導(dǎo)致細(xì)胞的代償效應(yīng)的發(fā)生以彌補正常mtDNA的拷貝數(shù)的不足。

最近，有研究顯示［29］循環(huán)mtDNA作為分子診斷靶標(biāo)，區(qū)分正常人與尤因氏肉瘤的敏感性和準(zhǔn)確性為76.1%和86.4%。隨后，研究人員［30］針對循環(huán)mtDNA的研究現(xiàn)狀、機遇與挑戰(zhàn)，以及存在的技術(shù)瓶頸做了總結(jié)和分析，認(rèn)為如果要深入探討循環(huán)mtDNA在臨床診斷中潛在應(yīng)用價值，擴大樣本量是非常必要的。

目前為止，腫瘤中循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)的研究還很少。目前研究顯示腫瘤中循環(huán)mtDNA的拷貝數(shù)絕大多數(shù)高于非腫瘤組，主要原因是腫瘤發(fā)生發(fā)展中有更多的炎癥，更多的細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡進入外周血。而Kohler等［28］在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了相反的變化，其可能原因是不同癌種可能存在不同的變化。另外筆者認(rèn)為該研究需要進一步擴大樣本量或者運用另一種方法進行定量檢測。相比于循環(huán)nDNA，循環(huán)mtDNA在檢測上更加容易，上述研究也顯示循環(huán)mtDNA有著更好的區(qū)分度，當(dāng)然這需要更多的研究進行驗證。不過循環(huán)mtDNA作為一個潛在的腫瘤指標(biāo)將越來越受到人們的關(guān)注。

3 總結(jié)

本文對腫瘤血漿中循環(huán)mtDNA的相關(guān)研究進行了綜述，目前為止血漿循環(huán)mtDNA的研究主要集中在定量檢測，定性檢測開展尚少。定量檢測優(yōu)勢在于通過對腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療過程中循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)水平變化的監(jiān)測，來對腫瘤診斷、治療效果、預(yù)后評估進行評價。定性檢測則側(cè)重通過對腫瘤相關(guān)突變位點的檢測，為臨床腫瘤診斷提供一種新的途徑。循環(huán)mtDNA釋放進入血液循環(huán)的機制認(rèn)為主要是腫瘤增生或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、壞死、炎癥的發(fā)生，進而引起血漿中mtDNA拷貝數(shù)的變化，以及線粒體功能障礙引起的mtDNA的釋放。另一方面，幾乎已在全部腫瘤中檢測到mtDNA突變，其與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性被越來越多的實驗所證實，因此血漿循環(huán)mtDNA突變的檢測有望成為腫瘤診斷的一個新的切入點。

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Research status of circulating mitochondrial DNA of tumor

JIN Tao1，XIN Yijuan2★
（1.Clinical Laboratory，the First People’s Hospital of Yong Kang，Yongkang，Zhejiang，China，321300；2.Clinical Laboratory，Xijing Hospital，Xian，Shanxi，China，710000）

In recent years，a growing number of studies have shown that tumor and non-tumor cells continually release DNA into peripheral blood in the progress of tumor growth.According to the source of circulating DNA，they are divided into circulating mitochondria DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）and circulating nuclear DNA （nuclear acid，nDNA）.To date，almost all studies focus on circulating nDNA research，as circulating mtDNA receives little attention.In this review，recent studies on circulating mtDNA qualitatively and quantitatively are concerned.We try to discuss the biological significance of circulating mtDNA in the development of the tumor and the potential clinical value in cancer diagnosis and therapeutic effect evaluation.

國家科技部863計劃（2011AA02A110）

1.永康市第一人民醫(yī)院檢驗科，浙江，永康 321300 2.西安市西京醫(yī)院檢驗科，陜西，西安 710000

辛毅娟，E-mail：xy850510@126.com