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    采用多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)對先天性心臟病患兒進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異分析

    2015-09-10 05:21:28羅世強(qiáng)嚴(yán)提珍唐寧黃際衛(wèi)廖鳳文李伍高李哲濤梁彪
    分子診斷與治療雜志 2015年1期
    關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)先天性探針

    羅世強(qiáng)嚴(yán)提珍唐寧黃際衛(wèi)廖鳳文李伍高李哲濤梁彪★

    采用多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)對先天性心臟病患兒進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異分析

    羅世強(qiáng)1,2嚴(yán)提珍1,2唐寧1,2黃際衛(wèi)1,2廖鳳文3李伍高1,2李哲濤1,2梁彪3★

    目的 探討多重連接依賴式探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技術(shù)在臨床上檢測先天性心臟病 (congenital heart disease,CHD)患者基因拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)的可行性,了解中國未挑選的先天性心臟病患兒中基因拷貝數(shù)變異的發(fā)生情況。

    方法 收集未挑選的125例先天性心臟病患兒,以100例年齡、性別匹配的健康兒童為正常對照組,采用MLPA技術(shù)(MLPA-kit P311試劑盒)對病例組和對照組的基因組DNA進(jìn)行分析。 結(jié)果 在125例先天性心臟病患兒中,發(fā)現(xiàn)5個22q11.2微缺失,陽性檢出率為4%(5/125)。在100例正常對照中均未檢出拷貝數(shù)變異。 結(jié)論 CNV是CHD的重要致病機(jī)制,而22q11微缺失是CHD患者中常見的CNV的類型之一。MLPA技術(shù)具有高通量、快捷及成本較低等特點(diǎn),可應(yīng)用于先天性心臟病基因拷貝數(shù)異常的檢測。

    先天性心臟?。–HD);多重連接依賴式探針擴(kuò)增(MLPA);基因拷貝數(shù)變異(CNV);22q11微缺失

    先天性心臟病 (congenital heart disease,CHD),簡稱先心病,是胎兒時(shí)期心臟、大血管發(fā)育異常而導(dǎo)致的先天性畸形疾病,在新生兒非感染性死亡中占首位,是導(dǎo)致嬰幼兒死亡、青少年及成人致殘的重要原因之一[1]。國外資料表明足月、活產(chǎn)嬰兒先心病的發(fā)病率是6‰ ~8‰。近年來先心病發(fā)病更呈上升趨勢,已位居國內(nèi)外出生缺陷病因首位[2,3]。隨著人類基因組測序的完成,一些新的遺傳變異被發(fā)現(xiàn)并日益受到重視。目前最受關(guān)注的是基因拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV),它是指人類基因組中廣泛存在的,從1000 bp到數(shù)百萬bp范圍內(nèi)的缺失、插入、重復(fù)和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異。CNV通過擾亂基因活性和改變基因劑量來影響基因表達(dá)、表型差異和表型適應(yīng),從而引起疾?。?]。目前大部分散發(fā)性CHD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,近年來,CNV與CHD發(fā)病關(guān)系的研究受到重視[5]。隨著多重連接依賴式探針擴(kuò)增(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)技術(shù)和比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomic hybridization,CGH)的出現(xiàn),越來越多的染色體不平衡變異在CHD患者中被發(fā)現(xiàn),為CHD的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究方向。Agergaard等[6]研究發(fā)現(xiàn)在CHD患者中,22q11.2缺失發(fā)生率達(dá)1.4~2.5%,其中以室間隔缺損(ventricular septal defect,VSD)的發(fā)生率最高。Posch等[7]研究顯示以間隔缺損為主的 CHD患者中存在 NKX2-5、GATA4、TBX5、BMP4、CRELD1基因的突變,但大部分散發(fā)病例突變陰性,是否存在上述基因的拷貝數(shù)變異尚不清楚。本研究通過MLPA技術(shù)對125例散發(fā)性CHD患者檢測 NKX2-5、GATA4、TBX5、BMP4、CRELD1基因拷貝數(shù)變異及22q11.2缺失在CHD患者的分布情況,旨在進(jìn)一步探討CHD發(fā)病機(jī)制。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象

    受檢對象來自于2012年1月至2014年6月柳州市婦幼保健院兒外科因CHD住院行心臟手術(shù)的125例兒童,其中男孩81例,女孩44例,年齡在8個月 ~17歲之間,均無親緣關(guān)系。所有患兒均經(jīng)心臟彩超、臨床、手術(shù)確診。CHD心臟分型情況見表1。本研究受檢對象均得到患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

    表1 125例先天性心臟病患兒心臟分型情況Table 1 Classification of 125 cases with CHD

    1.2 基因組DNA提取及濃度分析

    抽取患兒靜脈血2~4 mL,EDTA抗凝,采用酚-氯仿法提取基因組DNA,使用紫外分光光度計(jì)(GeneQuant 1300型,美國GE公司)測定所提取DNA在260 nm和280 nm處的吸光值,得出其濃度及純度,并用TE溶液稀釋至50 ng/μL的終濃度。純度要求A260/A280在1.7~2.0之間。

    1.3 MLPA分析

    本研究采用荷蘭MRC公司研發(fā)的SALSA MLPA P311-A2 CHD試劑盒,共44條探針,11條探針位于GATA4基因(外顯子1~7)及其上下游區(qū)域、4條探針位于NKX2-5基因內(nèi) (外顯子1和2)、10條探針位于TBX5基因內(nèi)(外顯子1~4,6~7,9~10,外顯子5和8除外)、4條探針位于BMP4基因內(nèi) (外顯子1,2,4,5)、2條探針位于CRELD1基因內(nèi) (外顯子3和10)、3條探針位于22q11區(qū)域 (包括CDC45、GP1BB和DGCR8基因)。 12p13、17q23、2p24、6p12、2q37、7p14、4q22、7q32、18p11和6q23各一條探針作為對照。

    1.3.1 多重探針雜交

    取待測樣本DNA 150 ng置于PCR管中,加TE至總體積為5 μL,于9700基因擴(kuò)增儀(9700型,美國ABI公司)上98℃變性5 min,快速降溫,25℃保持。取出PCR管后加入多重探針及MLPA緩沖液各1.5 μL,充分混勻后,95℃變性1 min,60℃雜交16~20 h,保持在54℃接著進(jìn)行多重探針連接反應(yīng)。

    1.3.2 多重探針連接反應(yīng)

    在上述PCR管內(nèi)加入連接酶-311 1 μL和連接酶緩沖液A、B各3 μL,及H2O 25 μL配成的連接混合液32 μL,54℃ 反應(yīng)15 min,然后98℃5 min滅活連接酶-311,15℃保存。

    1.3.3 多重PCR反應(yīng)

    在上述連接產(chǎn)物中,加入PCR引物及相應(yīng)緩沖液混合液2 μL、聚合酶0.5 μL、H2O 7.5 μL配制成的混合液10 μL,總反應(yīng)體系50 μL,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95℃變性 30 s、60℃退火30 s、72℃延伸60 s,35個循環(huán),72℃延伸20 min,15℃保存。每一批反應(yīng)均有兩個正常樣本作為對照(Human Genomic DNA,美國Promega公司)。

    1.3.4 MLPA產(chǎn)物分析和結(jié)果判讀

    利用遺傳分析儀(3500Dx型,美國ABI公司)對多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)采集,用GeneMapper 3.7軟件(美國ABI公司)獲得各探針位點(diǎn)峰高和峰面積。所采集的數(shù)據(jù)通過Coffalyser.Net專用軟件(荷蘭MRC公司)進(jìn)行分析,得出基因相對拷貝數(shù)比值(Ratio值)。根據(jù)試劑盒說明書,以Ratio值在0.7~1.3之間判定為正常,Ratio值<0.7為存在基因缺失,Ratio值>1.3為存在基因重復(fù)。

    2 結(jié)果

    2.1 125例CHD病患兒MLPA分析結(jié)果

    在125例CHD病患兒中,共檢出5例22ql1.2微缺失 (CDC45、GP1BB、DGCR8基因拷貝數(shù)缺失),陽性率為4.00%(5/125,見表2)。所有陽性樣本均由兩個研究者進(jìn)行了2次重復(fù)檢測,所得結(jié)果一致。5例22q11.2微缺失陽性病例中,4例為室間隔缺損 (VSD),1例為法洛四聯(lián)癥。在100例正常對照中均未檢測出上述變異。MLPA陽性病例的基因相對拷貝數(shù)比值(Ratio比值)見(表3)。部分陽性病例的毛細(xì)管電泳圖譜見圖1。

    表2 異常病例的檢測結(jié)果Table 2 The detection results of abnormal cases

    表3 MLPA陽性病例的基因相對拷貝數(shù)比值(Ratio比值)Table 3 The relative copy number ratio of MLPA positive cases(Rate ratio)

    圖1 部分樣本的典型毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)化后的柱形圖

    3 討論

    CHD是人類最常見的出生缺陷之一。目前,我國有CHD患者約400萬,其中復(fù)雜的、難治的或出生后易發(fā)生早期死亡的CHD約占20%以上。遺傳變異是其重要的致病因素之一,闡明疾病的分子機(jī)制是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的難題。近年來,隨著基因組學(xué)研究方法和技術(shù)的進(jìn)步,與疾病相關(guān)的遺傳變異逐漸被發(fā)現(xiàn),這些變異包括:染色體異常、CNV、新發(fā)突變和SNP等。染色體異常及CNV往往導(dǎo)致綜合征型CHD,表現(xiàn)為心臟、血管的發(fā)育異常,甚至心外畸形及多種功能異常[8]。目前,臨床對CHD的診斷主要依據(jù)臨床癥狀、體征、心臟彩色超聲、胸部X線及心電圖的結(jié)果,這些方法可以有助于對已發(fā)生心臟的畸形和功能異常進(jìn)行診斷,但無法對人群中CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估,采用現(xiàn)代分子診斷技術(shù)可對CHD患者在分子水平上進(jìn)行診斷,同時(shí)也有助于排查CHD的高危風(fēng)險(xiǎn)。目前用于檢測染色體異常和CNV的方法主要有核型分析和FISH,但是兩種技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且不利于發(fā)現(xiàn)新的變異及人群篩查,而MLPA是一種高通量檢測基因組序列中拷貝數(shù)變異的成熟技術(shù),可用于染色體異常和CNV等分子水平的檢測[9]。本研究采用的MLPA試劑盒P311覆蓋了與CHD發(fā)生相關(guān)的多個區(qū)域,包括常見的 22q11微缺失、GATA4、NKX2-5、TBX5、BMP4和CRELD1,共發(fā)現(xiàn)5例22q11微缺失的病例,證明這一試劑盒是CHD分子檢測可靠的方法,其結(jié)果可作為臨床診斷和產(chǎn)前診斷重要的補(bǔ)充。在產(chǎn)前診斷中,對于發(fā)現(xiàn)有陽性結(jié)果的胎兒家庭,我們告知其父母患兒出生后可能出現(xiàn)臨床表型,由患兒父母選擇是否引產(chǎn);CHD患兒的臨床表型有較高的異質(zhì)性,患兒出現(xiàn)癥狀的時(shí)間也不同,對于已出生的患兒,分子診斷有助于早發(fā)現(xiàn),提醒家長應(yīng)早期就診和及時(shí)干預(yù),避免延遲診斷所帶來的危害。

    本研究證實(shí) 22q11微缺失是導(dǎo)致廣西地區(qū)CHD最常見的病因。該變異導(dǎo)致的綜合征是由多基因缺陷所導(dǎo)致的先天性多器官發(fā)育異常的一種臨床癥候群,又叫“22q11微缺失綜合征”,主要的臨床表型有心臟畸形、異常面容、胸腺發(fā)育不良、腭裂和低鈣血癥,人群發(fā)生率約為1/4 000。該病為常染色體顯性遺傳病,93%為新發(fā)突變,7%來自父母的遺傳。在22q11缺失中,以經(jīng)典的3 Mb缺失最為常見,占87%,近端1.5 Mb缺失占8%,其余5%為不典型缺失[10]。本研究發(fā)現(xiàn)5例患者攜帶的均為經(jīng)典的3 Mb缺失。通過采用MLPA技術(shù)對CHD的患者進(jìn)行分析,證實(shí)用MLPA對CHD進(jìn)行分子診斷的可行性,說明 22q11微缺失是CHD常見的致病因素。同時(shí)也反應(yīng)了GATA4、NKX2-5、TBX5、BMP4和CRELD1的拷貝數(shù)變異不是CHD的常見致病因素。研究發(fā)現(xiàn)本地區(qū)CHD患者中22q11.2缺失發(fā)生率為4%,高于Agergaard等[6]研究發(fā)現(xiàn)的1.4% ~2.5%,可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)、不同民族間存在差異引起。

    CHD患兒結(jié)合臨床癥狀、體征、心臟彩色超聲、胸部X線及心電圖的結(jié)果,再加上多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)對基因拷貝數(shù)變異分析可對CHD在分子水平上進(jìn)行診斷,有助于排查CHD的高危風(fēng)險(xiǎn)。該技術(shù)對CHD患兒的早期診斷及胎兒的產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷意義更大,同時(shí)還可以結(jié)合其遺傳診斷結(jié)果對CHD手術(shù)患者術(shù)后的效果進(jìn)行評估??傊?,MLPA是一種能同時(shí)檢測多個基因上多個位點(diǎn),高通量、耗時(shí)短、相對價(jià)廉的檢測方法[11],值得在臨床推廣應(yīng)用。

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    Gene copy number variation analysis of children with congenital heart disease by using multiplex ligation dependent probe method

    LUO Shiqiang1,2,YAN Tizhen1,2,TANG Ning1,2,HUANG Jiwei1,2,LIAO Fengwen3,LI Wugao1,2,LI Zhetao1,2,LIANG Biao3★
    (1.Key Laboratory of Birth Defects Prevention and Control in Liuzhou City,Liuzhou,Guangxi,China,545001;2.Laboratory of Liuzhou Maternal and Child Health-Care Hospital, Liuzhou,Guangxi,China,545001;3.Pediatric Surgery of Liuzhou Maternal and Child Health-Care Hospital, Liuzhou,Guangxi,China,545001)

    Objective To investigate the efficiency of multiplex ligation dependent probe amplification(MLPA)method in detecting congenital heart disease(CHD)and evaluate the role of somatic copy number variation (CNV)in the genesis of CHD in China.Methods A total of 125 cases with CHD were collected.100 age and sex-matched normal subjects were served as control group.The genomic DNA from all the cases and healthy controls were detected by MLPA-kit P311.Results Of the 125 CHD patients,5 cases were detected with 22q11.2 microdeletion.The total detection rate is 4%(5/125).No CNVs was detected in the control group.Conclusion Somatic CNV plays an important role in the genesis of CHD,of which 22q11.2 microdeletion is one of the most significant and frequent CNV.MLPA is a high throughput,rapid and low-cost technique to detect CHD caused by CNV,including trisomies,microdeletion and microduplication.

    Congenital heart disease(CHD);Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA);Copy number variation(CNV);22q11 Microdeletion

    資金項(xiàng)目:柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20140020404)

    1.柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西,柳州 545001 2.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科,廣西,柳州 545001 3.柳州市婦幼保健院小兒外科,廣西,柳州 545001

    梁彪,E-mail:biaoge19651107@126.com

    注:羅世強(qiáng)和嚴(yán)提珍為并列第一作者

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