食品中金黃色葡萄球菌的檢測分析

逯 巖

撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧撫順 113006

金黃色葡萄球菌是人類生活中最常見的致病菌，其廣泛存在于自然界中，尤其是食品。金黃色葡萄球菌引發(fā)毒素型食物中毒的三大主因之一[1]。食品中超出一定數(shù)量的金黃色葡萄球菌就會導(dǎo)致食用者出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、發(fā)燒，甚至死亡的中毒事件[2]。隨著食品安全的逐步升級，對食品中金黃色葡萄球菌的檢測成為食品檢測中的重要內(nèi)容。近些年科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對金黃色葡萄球菌的檢測方法不斷更新，市面上涌現(xiàn)出多種方法進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測[3]。2013年6月—2014年6月采用對比方式對紙片檢測法進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

實驗材料選取該地市場和超市的肉制品、速凍食品及涼菜三大類食品，各20。平板計數(shù)瓊脂、B-P培養(yǎng)基、增菌劑（卵黃亞碲酸鉀）、金黃色葡萄球菌快速檢驗測試片、磷酸緩沖稀釋液、鮮兔血漿、抗凝劑（EDTA）及革蘭氏染液等。主要設(shè)備有：恒溫培養(yǎng)箱及水浴箱、振蕩器、顯微鏡、移液槍、天平、無菌工作臺、無菌均質(zhì)杯等。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備樣品 樣品的制備依GB4789.10-2010標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于B-P平板計數(shù)法操作：無菌狀態(tài)下取25 g樣品放入裝有225 mL磷酸緩沖稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為8000 r/min均質(zhì)120 s，制成固樣質(zhì)量比為1:10的樣品勻液，用平板計數(shù)進(jìn)行測定，每稀釋度操作2次重復(fù)測定。

1.2.2 金黃色葡萄球菌的紙片法 用移液槍將樣品勻液1 mL垂滴于掀開上層膜的測試片正中，緩慢蓋下上層膜，令接觸面里無氣泡，并專用壓板輕壓壓板液，使樣液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)面，靜置試片至少60 s，待膠體凝固于34～36℃或36～38℃條件下培養(yǎng)22～26 h。如均為暗紫紅色菌落或無菌落，則測試完成；若有黑或藍(lán)綠色可疑菌落，則在室溫為34～36℃或36～38℃條件下，繼續(xù)加入確認(rèn)反應(yīng)片培養(yǎng)1～3 h并觀察記錄結(jié)果。金黃色葡萄球菌計為全部暗紫紅色菌落；施用確認(rèn)片后，計數(shù)全部有或沒有菌落的粉紅色暈圈，無粉紅暈圈的菌落經(jīng)判定為革蘭氏桿菌或其他，不計數(shù)。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的B-P平板檢測法 可參見中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT0172-2010有關(guān)進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗方法的相關(guān)流程[4]。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行相關(guān)及差異性分析，比較這兩種方法的異同。

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 金黃色葡萄球菌檢出率

肉制品類檢出率分別為70%、40%；速凍食品中40%、10%；涼菜類均為20%。不同類別產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的檢出率與加工流程、流通渠道、包裝和產(chǎn)品特性等有不同程度的關(guān)系。肉類金黃色葡萄球菌檢出率高可能與其加工流程不進(jìn)行滅菌處理等操作不衛(wèi)生有關(guān)。此外，肉類銷售暴露在外界環(huán)境中時間較長，易受金黃色葡萄球菌的污染。速凍食品其相對濕潤的環(huán)境適宜金黃色葡萄球菌的繁殖，運輸及銷售環(huán)節(jié)也容易造成再污染。

兩種方法的符合率：肉制品類為100%、速凍食品中為80%、70%、涼菜類70%、50%，其原因可能是食品基質(zhì)差異性造成。

2.2 統(tǒng)計分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對紙片法與B-P平板計數(shù)法的實驗結(jié)果進(jìn)行樣品t檢驗F檢驗對比，結(jié)果見表1。

表1 紙片法及B-P平板計數(shù)法的相關(guān)性及顯著性

全部樣品顯著概率P＞0.05，檢測無差異。肉類相關(guān)系數(shù)近0.89，速凍食品及涼菜類相關(guān)系數(shù)均在0.95以上，總相關(guān)系數(shù)達(dá)0.905，說明兩種檢測法線性密切相關(guān)。由回歸方程的假設(shè)檢驗可知，F(xiàn)分布的顯著概率均為零，說明兩變量間的具有極為顯著的線性相關(guān)。

2.3 兩種檢測的其他指標(biāo)

兩種方法的其他指標(biāo)評價，詳見表2。

表2 紙片法和B-P平板計數(shù)法其他指標(biāo)比較

從易操度及勞動強度看，紙片法前期預(yù)制的培養(yǎng)基系統(tǒng)可省去大量繁瑣準(zhǔn)備工作，培養(yǎng)后僅對疑似菌落進(jìn)行確認(rèn)反應(yīng)處理即可進(jìn)行最終判定，與B-P平板計數(shù)法相比易操作且勞動強度小。B-P平板計數(shù)法需涂布瓊脂平板培養(yǎng)48 h的實驗流程，再對球菌菌落施行兔血漿凝固酶實驗，手續(xù)繁瑣且工作量大。

從計數(shù)準(zhǔn)確度看，紙片法在接入菌液后，采用專用壓板按壓樣液，可控制其均勻分布在計數(shù)格內(nèi)，極少出現(xiàn)蔓延菌落生長現(xiàn)象。計數(shù)時僅需單位方格內(nèi)的菌落與總方格數(shù)乘積即可實現(xiàn)。操作環(huán)節(jié)少了人為干預(yù)，流程作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，誤差小。從檢測時長看，紙片法接種后培養(yǎng)22～26 h，對實施確認(rèn)反應(yīng)片的菌落培養(yǎng)1～3 h，耗時不超過29 h；B-P平板計數(shù)檢測法從接種培養(yǎng)到血漿凝固酶驗證環(huán)節(jié)，所耗時長為72～96 h。前者極大縮短了檢測時長[5]。

從培養(yǎng)基選擇性看，紙片檢測的60個樣品中，可疑菌落較多，紫紅色菌落相對較少。加確認(rèn)片反應(yīng)后，極少可疑菌落呈粉紅色暈圈，故可判定這些黑色菌落基本為雜菌，這表明紙片法培養(yǎng)的了過多雜質(zhì)，選擇性差。

3 討論

3.1 檢測結(jié)果分析

根據(jù)統(tǒng)計分析表明，二者線性相關(guān)關(guān)系極為顯著，并無明顯差異且符合良好。二者在檢測結(jié)果上并無實質(zhì)差異，表現(xiàn)的一致性較好。兩種方法的其他指標(biāo)對比顯示，紙片法的易操性、勞動強度、計數(shù)準(zhǔn)確度及計數(shù)時長均優(yōu)于B-P平板計數(shù)檢測法。

3.2 兩種檢測法的劣勢

二者的缺點均體現(xiàn)在對金黃色葡萄球菌的選擇效果較弱，易受雜菌干擾所造成的判讀難方面。紙片法判讀過程中發(fā)現(xiàn)有些較深的紫紅菌落與較淺的黑色菌落色系極為接近，很難分辨清楚，容易在視覺上產(chǎn)生顏色識別判定錯誤的問題。這一現(xiàn)象在肉類及速凍食品表現(xiàn)極為突出。這一點在早前的一些相關(guān)文獻(xiàn)中可以得到證實。因此，需要進(jìn)一步研發(fā)更具選擇性的培養(yǎng)基是提升檢測的準(zhǔn)確性的緊要課題。

3.3 比較結(jié)果

盡管紙片法成本花費高，但隨著科技的發(fā)展，國內(nèi)也將能提供與國外紙片相媲美的低成本紙片，且由于紙片法的綜合性與B-P平板計數(shù)檢測法相比更易操作、省時省力，因此值得被廣泛應(yīng)用于未來實際檢測行業(yè)及部門中。

[1]劉海卿，佘之蘊，陳丹玲，等.金黃色葡萄球菌三種定量檢驗方法的比較[J].食品研究與開發(fā)，2014（13）：113-115.

[2]柳敦江.王鵬.一種快速鑒定豬舍空氣樣品中金黃色葡萄球菌的方法[J].豬業(yè)科學(xué)，2013（5）：96-97.

[3]萬婧，周向陽，張曉峰，等.雙重PCR-DHPLC技術(shù)快速檢測水產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌[J].食品科學(xué)，2013（6）：119-203.

[4]胡守奎，胡萬富，撒楠.應(yīng)用測試片法快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011（5）：45-46.

[5]李環(huán)，劉威，鄒大陽.基于顏色判定的DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法快速檢測金黃色葡萄球菌[J].軍事醫(yī)學(xué)，2013（12）：104-105.