RNA干擾FABP5基因對人肝癌HepG2細胞裸鼠移植瘤生長的影響*

周玲麗， 曹 驥， 李 薇 ， 羅 旺 ， 楊香娣 ， 楊 春， 駱成飄， 唐艷萍， 李 瑗

(1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實驗研究部, 2廣西醫(yī)科大學研究生學院，廣西 南寧 530021)

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RNA干擾FABP5基因對人肝癌HepG2細胞裸鼠移植瘤生長的影響*

周玲麗1,2， 曹 驥1△， 李 薇1,2， 羅 旺1,2， 楊香娣1,2， 楊 春1， 駱成飄1， 唐艷萍1， 李 瑗1

(1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實驗研究部,2廣西醫(yī)科大學研究生學院，廣西 南寧 530021)

目的： 研究脂肪酸結合蛋白5(FABP5)基因沉默的慢病毒載體對人肝癌HepG2細胞成瘤效應的影響。方法: 采用RNA干擾技術構建重組逆轉錄慢病毒載體。HepG2細胞分為3組：實驗組以FABP5基因沉默慢病毒顆粒(LV-shRNA-FABP5)感染HepG2細胞；陰性對照組以空載體慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC)感染HepG2細胞；空白對照組不做任何處理。將裸鼠隨機分為3組，接種腫瘤細胞后觀察裸鼠成瘤情況。4周后測量腫瘤的體積和重量，繪制移植瘤生長曲線。Real-time PCR、Western blot及免疫組織化學法檢測裸鼠移植瘤中FABP5的表達。結果: LV-shRNA-FABP5可以降低HepG2細胞FABP5的表達。3組裸鼠接種癌細胞后均有腫瘤形成。與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組腫瘤生長速度明顯減慢，且體積及重量明顯減小(P<0.05)；實驗組裸鼠肝癌移植瘤組織的FABP5 mRNA和蛋白表達水平相比空白對照組和陰性對照組表達明顯下降(P<0.05)。結論: 沉默F(xiàn)ABP5基因表達能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長。FABP5可能成為肝癌基因治療的一個有效靶點。

RNA干擾； 脂肪酸結合蛋白5； 肝癌； 裸鼠； 移植瘤； 基因治療

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為常見的的惡性腫瘤之一，而且預后差。2007年全世界肝癌的死亡例數(shù)達到68 000，在全球的腫瘤死亡原因中位居第三，其中55%以上發(fā)生在中國[1]。發(fā)現(xiàn)和了解肝癌形成的關鍵分子對于研究肝癌發(fā)生發(fā)展機制和實現(xiàn)基因的靶向治療有著重要的意義。脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding proteins，F(xiàn)ABPs)是一組多源性的小分子胞內蛋白質，廣泛存在于哺乳動物的小腸、肝臟、脂肪、心腦等多種細胞內，其中表皮相關型又稱為FABP5。FABP5與包括腫瘤在內的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)細胞表達的FABP5不僅可以轉運脂肪酸為細胞生長提供能量及原材料，而且可以結合和轉運各種配體，參與腫瘤生長相關的信號轉導[2]。本課題組前期應用跨種屬腫瘤基因篩選策略，篩選出多種作用于肝癌的關鍵分子，且通過研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中FABP5的表達顯著上調[3-5]。首先我們采用RNA干擾技術構建了FABP5-shRNA慢病毒載體，沉默HepG2細胞中的FABP5基因，成功驗證了其能明顯降低FABP5的表達。本研究通過構建裸鼠肝癌移植瘤模型，觀察HepG2細胞中FABP5基因沉默后對裸鼠移植瘤生長情況的影響，從而進一步探討FABP5在肝癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細胞株HepG2和慢病毒購自上海吉凱基因技術有限公司；30只雌性BALB/c裸鼠，4～6 周齡，(16±3)g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心(許可證號：SCXK桂2009-0002)；DMEM、胎牛血清和PBS均購自Hyclone；Trizol試劑購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自Fermentas；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；Western blot及IP細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、5×SDS蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測試試劑盒(增強型)、20×TBS緩沖液等均購自江蘇碧云天生物技術研究所；蛋白質預染Marker購自Fermentas；PVDF膜購自Millipore；兔抗人FABP5單克隆抗體購自Abcam；兔抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz；免疫組化SP試劑盒和DAB濃縮顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Real-time PCR儀購自Bio-Rad。PCR引物采用Primer 5.0設計，由上海生工生物工程公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清，加1×105U/L左氧氟沙星的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2 慢病毒載體轉染人肝癌細胞HepG2 轉染前12 h取對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化后進行細胞計數(shù)，將細胞接種于6孔板中，每孔細胞數(shù)約為6×105，按MOI=10的條件下，待細胞融合度達20%左右時進行轉染，實驗組中加入LV-shRNA-FABP5(干擾序列為5’-TGGGAAGGAAAGCACAATA-3’)，陰性對照組加入LV-shRNA-NC(干擾序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，每組均設3個重復孔，每孔均加入polybrene及感染增強液，增強病毒的感染力?？瞻讓φ战M常規(guī)培養(yǎng)(control組)。通過預實驗確定嘌呤霉素的最終工作濃度為3 mg/L，轉染72 h后每孔加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉染的細胞，96 h后熒光最強，在熒光顯微鏡下觀察細胞的轉染情況。之后使用含0.1 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞，保持病毒整合后的穩(wěn)定性。

2.3 構建肝癌裸鼠移植瘤模型 按照隨機分組的原則將30只雌性裸鼠隨機分成3組，分別作為空白對照組、陰性對照組和實驗組。胰酶消化處于對數(shù)生長期的各組細胞，離心并計數(shù)后用血清制成約1×1010/L的細胞懸液，分別接種于3組裸鼠右腋下0.5 cm處，實驗組接種轉染LV-shRNA-FABP5的HepG2細胞，陰性對照組接種轉染LV-shRNA-NC的HepG2細胞，空白對照組接種正常培養(yǎng)的HepG2細胞。裸鼠在SPF級動物房中飼養(yǎng)， 4周后處死，完整剝離腫瘤組織后稱瘤體重量并計算腫瘤體積。腫瘤體積 (mm3)=長徑×短徑2/2。取適當瘤體組織置于-80 ℃冰箱中，用于做real-time PCR及Western blot實驗，剩余瘤體組織置于4%多聚甲醛溶液中固定做免疫組織化學實驗。

2.4 實時熒光定量PCR檢測瘤組織中FABP5 mRNA的表達 Trizol法分別提取3組腫瘤組織總RNA，并逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增反應。FABP5的上游引物為5’-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3’，下游引物為5’-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3’；內參照GAPDH的上游引物為5’ -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。反應體系為20 μL，SYBR 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水8 μL。采用2-ΔΔCt分析法，Ct值為每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)。以GAPDH為內參照。

2.5 Western blot檢測裸鼠移植瘤中FABP5蛋白的表達 提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑測定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。常?guī)制膠、上樣，進行蛋白質電泳；轉膜；用TBST配制5%脫脂牛奶封閉1 h，然后FABP5和β-actin I抗4 ℃下孵育過夜(FABP5 的I抗稀釋度為1∶200)，第2天用TBST洗膜，室溫搖床孵育II抗(II抗稀釋度均為1∶10 000)1 h，TBST洗膜5 min 3次。采用ECL化學發(fā)光法顯色，對PVDF膜進行掃描，獲取圖像。

2.6 免疫組織化學檢測腫瘤組織中FABP5蛋白的表達 從裸鼠右腋下取腫瘤組織，用4%多聚甲醛液固定，脫水后石蠟包埋腫瘤組織，連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟處理。實驗過程采用SP法，步驟按照試劑盒說明書進行操作。兔抗FABP5單克隆抗體1∶200稀釋，DAB顯色，蘇木素復染。用已知陽性切片作陽性對照，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)代替 I 抗作為陰性對照。免疫組織化學染色結果判斷：FABP5蛋白以細胞核或(和)細胞漿呈黃色顆粒為陽性，綜合強度和陽性細胞數(shù)量進行判定。(1)按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。(2)按陽性細胞率評分：陽性細胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。取2項評分的乘積作為總評分：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為中等強度陽性(++)；≥9分為強陽性(+++)。以乘積0～3分為陰性表達，≥4分為陽性表達。其中以陰性(-)和弱陽性(+)記為低表達組，以中陽性(++)和強陽性(+++)記為高表達組。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；免疫組化各計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 慢病毒感染HepG2細胞

在MOI值為10的條件下，實驗組和陰性對照組中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)于72 h開始表達，96 h表達穩(wěn)定增強。由圖可知96 h熒光顯微鏡下細胞轉染的情況，慢病毒感染HepG2細胞的效率>95%，圖1。

Figure 1.Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells transfected with the recombinant lentivirial vector and GFP expression examined using fluorescence microscopy (×200).

圖1 慢病毒感染HepG2細胞

2 動態(tài)觀察裸鼠移植瘤

大約1周左右，各組裸鼠右腋下均有肉眼可見的腫瘤長出，成瘤率100%。從各組裸鼠成瘤開始，分別在接種第1、2、3、4周測量移植瘤體積，然后繪制生長曲線。4周連續(xù)觀察3組裸鼠的成瘤體積，結果得出實驗組腫瘤生長緩慢且體積明顯小于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組裸鼠成瘤28 d后，將裸鼠處死并完整剝離皮下腫瘤，測量腫瘤體積和重量，結果見圖2、3。各組裸鼠移植瘤生長曲線見圖4?？瞻讓φ战M、陰性對照組和實驗組的瘤體平均體積分別為(100.51±47.45)mm3、(104.02±52.89)mm3和(29.41±8.98)mm3，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5；空白對照組、陰性對照組和實驗組的瘤體重量平均分別為(0.632±0.203)g、(0.629±0.226)g和(0.204±0.067)g，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 2.The tumor formation of the nude mice 4 weeks after transplantation of HepG2 cells transfected with different RNAi lentiviral vectors.

圖2 4周后各組裸鼠移植瘤大小的比較

Figure 3.The volumes of the transplanted tumors 4 weeks after transplantation of HepG2 cells transfected with different RNAi lentiviral vectors.

圖3 4周后各組裸鼠移植瘤大小的比較

Figure 4.The growth curves of the subcutaneously transplanted tumors in the nude mice. Mean±SD.n=10.

圖4 裸鼠皮下移植瘤的生長曲線

Figure 5.The changes of the tumor volumes in the nude mice 28 d after transplantation. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖5 28 d后各組裸鼠移植瘤體積的比較

Figure 6.The changes of the tumor weight in the nude mice 28 d after transplantation. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖6 28 d后各組裸鼠移植瘤重量的比較

3 Real-time PCR檢測各組裸鼠皮下移植瘤中FABP5 mRNA的表達

Real-time PCR結果顯示，空白對照組和陰性對照組、實驗組瘤組織中FABP5 mRNA的相對表達量分別為1.112±0.107、1.068±0.114和0.145±0.046。實驗相比陰性對照組和空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義，陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖7。

4 Western blot檢測各組裸鼠皮下移植瘤組織中FABP5蛋白表達

以β-actin為內參照，實驗組分別與空白對照組和陰性對照組相比，F(xiàn)ABP5蛋白水平均減少達80%以上，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。該結果提示RNA干擾沉默F(xiàn)ABP5基因可顯著減少裸鼠移植瘤組織中的FABP5蛋白的表達，見圖 8。

Figure 7.The effects of LV-shRNA-FABP5 on the mRNA expression of FABP5 in the subcutaneous tumor tissues detected by real-time PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖7 Real-time PCR檢測LV-shRNA-FABP5對裸鼠移植瘤FABP5 mRNA表達的影響

Figure 8.The relative protein levels of FABP5 in the subcutaneous tumor tissues determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖8 FABP-5蛋白在各組移植瘤組織中的相對表達量

5 免疫組織化學法檢測移植瘤組織FABP5蛋白表達情況

裸鼠肝癌移植瘤組織表達FABP5陽性信號定位于細胞核和(或)細胞漿中，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色(圖9)。實驗組中FABP5蛋白的表達明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義，而空白對照組和陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，見表1。這表明實驗組FABP5蛋白表達在RNA干擾后顯著減少。

討 論

FABP5是FABPs的家族成員之一，主要來源于表皮細胞，分子量為15 kD，由135個氨基酸組成，其編碼基因已被克隆和測序，位于人8號染色體的q21.13區(qū)。FABP5主要參與脂肪酸的運輸代謝、細胞內信號轉導、基因表達等[6]。FABP5作為維甲酸(retinoic acid，RA)的轉運蛋白，結合并轉運RA，活化過氧化物酶體增殖物激活受體 β/δ(peroxisome proliferator-activated receptor β/δ，PPARβ/δ)，進而調節(jié)細胞分化、促進細胞增殖和抑制細胞的凋亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)FABP5與多種腫瘤有關，早在1999年就發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的耐藥細胞株該基因表達上調。此外，在黑色素瘤[8]、肝內膽管細胞癌[9]、子宮內膜癌[10]等腫瘤中FABP5的表達量均增加。Forootan等[11]用前列腺PC-3M細胞接種于裸鼠體內，成瘤后將FABP5小干擾RNA注射到腫瘤周圍，結果腫瘤的平均大小比對照組小3倍以上；免疫組織化學和Wes-tern blot提示實驗干擾組瘤組織中FABP5蛋白的表達水平低于對照組，推測FABP5水平下調可以抑制前列腺癌的發(fā)生。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中FABP5表達高的患者預后差，F(xiàn)ABP5基因的表達情況是影響乳腺癌患者預后的獨立因素。Uma等[13]研究比較舌鱗狀細胞癌的原位癌組織和發(fā)生淋巴結轉移的癌組織，發(fā)現(xiàn)有67%的原位癌組織FABP5 mRNA表達量是其轉移后的癌組織中表達量的4倍，提示FABP5不但可以促進舌鱗狀細胞癌的發(fā)生，還參與其轉移過程。

Figure 9.The protein expression of FABP5 in the subcutaneous tumor tissues detected by immunohistochemical staining (×400).

圖9 免疫組織化學染色法檢測FABP5蛋白在各組移植瘤組織中的表達

表1 FABP5在各組移植瘤組織中的表達

*P<0.05vscontrol.

本研究構建了人肝癌裸鼠移植瘤模型，將FABP5基因沉默重組慢病毒顆粒(LV-shRNA- FABP5)組、空載體慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC)組和空白對照組3組腫瘤細胞培養(yǎng)后分別種植于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)3組接種后均可見成瘤，但實驗組的成瘤速度和瘤體積大小明顯低于空白對照組和陰性對照組，而空白對照組和陰性對照組比較無明顯差異。人肝癌HepG2細胞株異體移植成功率達到100%，說明通過皮下注射成瘤建立的人肝癌裸鼠移植瘤模型是可行的。Real-time PCR和Western blot檢測結果中，實驗組移植瘤組織中FABP5的mRNA和蛋白表達水平均比其它2組顯著降低。免疫組織化學法顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組移植瘤組織中FABP5蛋白的表達陽性率明顯下降。

綜上所述，RNA干擾技術沉默人肝癌HepG2細胞中FABP5基因不僅能夠明顯抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長，而且可以降低瘤組織FABP5的表達水平。因此，F(xiàn)ABP5基因有望成為肝癌個性化靶向治療研究的新方向。

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Effects of RNA interference ofFABP5 on subcutaneous tumor of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 transplanted in nude mice

ZHOU Ling-li1, 2, CAO Ji1, LI Wei1, 2, LUO Wang1, 2, YANG Xiang-di1, 2, YANG Chun1, LUO Cheng-piao1, TANG Yan-ping1, LI Yuan1

(1ResearchDepartment,GuangxiCancerInstituteofGuangxiZhuangAutonomousRegion,2GraduateSchoolofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:caojicn@163.com)

AIM: To investigate the effect of recombinant lentiviral vector for RNA interference (RNAi) on the expression of fatty acid-binding protein 5 (FABP5) gene in hepatocellular carcinoma HepG2 cells and tumor formation in nude mice. METHODS: RNAi lentiviral vector was used in the experiment. Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were divided into 3 groups: the HepG2 cells in experimental group were transfected with the recombinant lentivirirus vector LV-shRNA-FABP5, the cells in negative control group were transfected with a control lentiviral vector LV-shRNA-NC, and the cells in normal control group were without any treatment. The nude mice were randomly divided into 3 groups. The growth of the transplanted tumor cells in the nude mice was observed. The tumor growth curve, volume and weight were determined 4 weeks after the cell inoculation. The expression of FABP5 was detected by real-time PCR, Western blot and immunohistochemical staining. RESULTS: Transfection of the lentiviral vector FABP5-shRNA obviously reduced FABP5 expression in the HepG2 cells. Tumor formation was all positive in the 3 groups of the nude mice inoculated with the tumor cells. Compared with normal control group and negative control group, the tumor growth slowed significantly in experimental group with smaller volume and weight. FABP5 expression in the transplanted tumor tissues was significantly down-regulated at mRNA and protein levels in experimental group as compared with normal control group and negative control group. CONCLUSION: RNAi-induced down-regulation ofFABP5 effectively inhibits the growth of transplanted hepatocellular carcinoma, suggesting thatFABP5 gene may be an effective target for gene therapy in treating liver cancer.

RNA interference; Fatty acid-binding protein 5; Liver cancer; Nude mice, Neoplasm transplantation; Gene therapy

1000- 4718(2015)04- 0603- 06

2014- 10- 30

2014- 12- 19

國家自然科學基金資助項目(No. 30960428)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.005

△通訊作者 Tel: 0771-5310593; E-mail: caojicn@163.com