兩組中藥方劑對糖尿病足產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和MRSA體外藥物敏感性試驗結(jié)果分析

梁曉誼，朱海英，劉笑梅，潘敏

(華佗醫(yī)院檢驗科，廣東肇慶526040)

兩組中藥方劑對糖尿病足產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和MRSA體外藥物敏感性試驗結(jié)果分析

梁曉誼，朱海英，劉笑梅，潘敏

(華佗醫(yī)院檢驗科，廣東肇慶526040)

目的了解黃連液和黃連液聯(lián)合麝香2組方劑對糖尿病足常見多重耐藥菌——產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抑菌和治療效果。方法收集確診為糖尿病足的患者，經(jīng)細菌培養(yǎng)分離出病原菌138株，篩選出其中的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和MRSA共67株，運用瓊脂稀釋法檢測中藥組方一(黃連液)及組方二(黃連液聯(lián)合麝香)對2種病原菌的最小抑菌濃度(MIC)。同時觀察2組方劑對糖尿病足的治療效果。結(jié)果組方一對35株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC≥128 mg/mL，而組方二其MIC值下降至32 mg/mL，組方二的MIC值范圍為32～128 mg/mL。32株MRSA的MIC值也從組方一的32 mg/mL降至組方二的8 mg/mL。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，加入麝香的組方二對2種細菌的MIC值較組方一下降明顯，并且療效顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論用中藥組方黃連液聯(lián)合麝香對糖尿病足常見的病原菌——產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和MRSA具有顯著的抑菌作用，這為今后的臨床治療提供了一種新的方法。

中藥敏感性試驗;超廣譜β－內(nèi)酰胺酶;大腸埃希菌;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;黃連液;麝香;糖尿病足

糖尿病足是常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，可引起足部潰瘍、感染、壞疽，嚴(yán)重時可致截肢[1]。目前西醫(yī)的治療方法主要是清創(chuàng)和控制感染，但由于大量廣譜抗菌藥物的濫用，引起了正常菌群失調(diào)和耐藥菌株的產(chǎn)生。根據(jù)徐靈芝等[2]的研究表明，糖尿病足的致病菌主要是大腸埃希菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌等。尤其對于產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(extendedspectrum beta lactamase，ESBLs)大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)所引起的感染常呈現(xiàn)出復(fù)雜性、難治性等特點，給臨床治療造成了較大的困難[3]。大量的臨床資料顯示，中醫(yī)藥治療糖尿病足副作用小[4]，華佗醫(yī)院采用中藥方劑黃連液外敷治療糖尿病足也取得了良好的效果，現(xiàn)在原有的基礎(chǔ)組方上增加單味麝香，新組方顯示出更有效的抑菌作用，可加速潰瘍面的愈合。為128/3、64/3、32/3、16/3、8/3、4/3、2/3、1/3、0.5/3、0.25/3 mg/mL。

4.菌液制備菌種復(fù)蘇，傳代培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取4～5個菌落接種于水解酪蛋白胨肉湯中，35℃2～8 h，用生理鹽水校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。

二、方法

1.瓊脂稀釋法將2組含不同濃度抗菌藥物的瓊脂平板和一個不含藥物作空白對照用的瓊脂平板的底部分別用筆畫出放射狀小格并編號。吸取制備好的菌液1～2 mL點種于含藥瓊脂平板表面相應(yīng)的小格內(nèi)，每點菌落數(shù)約1×104cfu，形成直徑5～8 mm的菌斑。置35℃18～24 h觀察結(jié)果。一個平板接種12個菌株，可同時測定12個菌株的最低抑菌濃度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

2.多重耐藥菌及篩選標(biāo)準(zhǔn)多重耐藥菌主要是指對臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時呈現(xiàn)耐藥的細菌[6]。根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(ClinicalandLaboratoryStandards Institute，CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)[7]進行篩選，采用瓊脂稀釋法檢測苯唑西林MIC＜2 μg/mL的金黃色葡萄球菌判定為MRSA;采用肉湯稀釋法檢測頭孢噻肟或頭孢他啶加入4 μg/mL克拉維酸后MIC比單藥降低3個倍比稀釋度以上視為菌株產(chǎn)ESBLs。

3.治療方法對照組用熬制的復(fù)方黃連液原液充分浸泡潰瘍面20 min，浸泡完畢用滲透黃連液的無菌紗布覆蓋固定;觀察組浸泡完畢后用無菌紗布拭干，在創(chuàng)面上均勻涂布已溶解的麝香粉劑(0.2 g/支)，再蓋上無菌紗布，膠布固定，每2天換藥1次，4周后作療效評定。

4.療效標(biāo)準(zhǔn)參照1997年衛(wèi)生部制定的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]。臨床治愈:局部腫脹消失，皮膚顏色復(fù)常，潰瘍面完全愈合;顯效:局部腫脹及皮膚顏色明顯改善，潰瘍面縮小70%以上;有效:局部腫脹及皮膚顏色明顯改善，潰瘍面縮小30%以上;無效:達不到有效指標(biāo)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，對計數(shù)資料的對比采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源收集華佗醫(yī)院2012年3月至2013年4月間住院治療的糖尿病足患者，年齡43～76歲。取足部潰瘍、腐爛標(biāo)本經(jīng)細菌培養(yǎng)、鑒定為細菌性感染的病原菌138株，再從中篩選出MRSA32株，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌35株，共67例作為療效觀察組，剩下71例作為療效對照組。各菌株固體瓊脂穿刺培養(yǎng)，石臘封存。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)。

2.中藥藥液的制備由華佗醫(yī)院制劑室中藥師配制。所有中藥均購自廣東和翔中藥飲片廠。組方一:黃連液提取液2 000 mL，該處方是由黃柏、黃連、黃芩、梔子等組成，每種中藥準(zhǔn)確稱量后用蒸餾水浸泡30 min，加熱煮沸后改文火熬30 min，過濾取汁，藥渣再加入蒸餾水同法煎熬20 min，通過充分煎煮，使藥物中的有效成分完全析出，過濾后兩汁液混合煎至濃縮成1∶1液，成流浸膏劑，即每1毫升藥液相當(dāng)于1 g原生藥[5]，用2.5 mol/L NaOH校正pH值至7.2。組方二:溶解1 g麝香備用，黃連液提取液2 000 mL。

3.中藥瓊脂平板的制備將抗菌藥物原液進行濃度遞減稀釋，稀釋后的藥物濃度分別為1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 mg/mL，分裝成2組試管，每組30管，并在第2組試管中每管加入相當(dāng)于30 mg麝香溶解物，充分混勻。然后以1∶9的比例將已倍比稀釋的不同濃度藥液加入水解酪蛋白胨瓊脂中，充分混勻后傾入無菌平皿中，此時第1組含藥瓊脂的含藥濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，第2組

結(jié)果

一、體外藥物敏感性試驗

用瓊脂稀釋法測定2組中藥方劑對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和MRSA的MIC值，結(jié)果判定以試驗菌株在最低濃度時即被抑制表示對該組方敏感。試驗結(jié)果顯示，組方一對ESBLs大腸埃希菌和MRSA的MIC值分別為128和32 mg/mL，組方二的MIC值分別為32/3和8/3 mg/mL，2種細菌均在增加麝香的組方二中比組方一有更大的抑菌作用。

二、療效觀察

兩組患者通過對比研究，觀察治療組的臨床療效明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 13.73，P＜0.005)。見表3。

討論

隨著臨床上抗菌藥物的不合理使用，耐藥菌株不斷增加和播散，抗菌藥物的耐藥狀況日趨嚴(yán)峻，特別是對產(chǎn)ESBLs的革蘭陰性桿菌，它不僅能分解第1、2代頭孢菌素，而且能分解廣譜頭孢菌素和單酰胺類抗菌藥物，增加了臨床感染性疾病的治療難度。而MRSA更是呈現(xiàn)多重耐藥性，耐藥率已超過50%[9]。對于糖尿病足患者因全身抵抗力低下和足部組織壞死因素等，感染了多重耐藥菌后更難以控制。

在抗菌藥物選擇壓力增大的情況下，中藥有著與抗菌藥物不同的作用機制，而且它們的抑菌作用同細菌的特性無關(guān)，這是中藥不同于西藥的獨到之處。華佗醫(yī)院早于1995年開始利用中藥泡洗和外敷，通過熱和藥的雙重作用治療糖尿病足、褥瘡等，取得良好的效果[10]。本研究組方一中的黃連液處方是由黃柏、黃連、黃芩、梔子等中藥組成，此方具有清溫?zé)?、除燥濕、瀉火、解毒的功效，對患者進行療效觀察，治愈率達26.8%，總有效率達69.0%。隨著細菌的不斷變異，特別是多重耐藥菌的感染正呈逐年遞增的趨勢[11]，在耐藥性不斷增加的壓力下，我們在原有的基礎(chǔ)組方上加入麝香，麝香有開經(jīng)絡(luò)、辟惡氣、殺蟲、解毒的功效，可治療一切癥瘕瘡癰，在治療效果上比組方一更勝一籌，治愈率為40.3%，總有效率更達91.0%。從試驗結(jié)果中我們可以看到中藥組方黃連液聯(lián)合麝香對糖尿病足的常見病原菌有著明顯的抑制作用。與組方一相比，組方二加入麝香后對2種細菌的MIC都有明顯的下降。對于產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，MIC由原來的128 mg/mL降至32/3 mg/mL，在此濃度下，菌株受到明顯的抑制;同樣，MRSA的MIC也由32 mg/mL下降至8/3 mg/mL，使試驗菌株的生長得到進一步抑制，這為臨床的藥效評估提供了合適的濃度和劑量參考。本試驗結(jié)果表明，黃連液聯(lián)合麝香比原組方的抑菌作用明顯增強，為臨床治療糖尿病足提供了一種新的有效方法。對于那些抗菌藥物無效的多重耐藥菌，中藥將成為控制感染的另一選擇。但由于現(xiàn)階段中藥的體外藥物敏感性試驗(瓊脂稀釋法)操作比較繁瑣，缺少完整的檢測方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。期待不久的將來中藥也有自己標(biāo)準(zhǔn)的體外藥物敏感性試驗方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。

[1]龔嵐.黃蓮與冰繃散治療糖尿病足潰瘍的效果觀察[J].護理學(xué)報，2010，17(12):62－63.

[2]徐靈芝，楊葉虹，葉紅英，等.糖尿病足感染的細菌學(xué)特點與預(yù)后分析[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2008，10 (4):451－452.

[3]董春雷，朱長太.醫(yī)院分離病原菌分布及藥物敏感性分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26(10):658－661.

[4]盧雯玲，劉銅華.中醫(yī)藥防治糖尿病足的研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2006，18(10):25－28.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:工業(yè)出版社，2005:679.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.多重耐藥菌醫(yī)院感染預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)[S].衛(wèi)辦醫(yī)改發(fā)[2011]5號，衛(wèi)生部，2011.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standerds for antimicrobial susceptibility testing; Twenty－second informational supplement[S].M100－S22，CLSI，2012.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:30.

[9]倪語星，尚紅，劉運德，等.臨床微生物學(xué)檢驗[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:4.

[10]李碧娟，胡娟娟，劉燕媚，等.中藥泡足治療糖尿病足的效果觀察[J].護理學(xué)報，2009，16(2):63－64.

[11]李繼霞，公衍文.多重耐藥菌醫(yī)院感染狀況分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28(9):784－788.

(本文編輯:姜敏)

2015年《檢驗醫(yī)學(xué)》開設(shè)繼續(xù)教育項目的通知

為滿足全國檢驗醫(yī)學(xué)工作者，尤其是基層和地處偏僻地區(qū)的醫(yī)學(xué)檢驗工作者對繼續(xù)教育的需求，充實基礎(chǔ)理論知識、促進檢驗醫(yī)學(xué)水平、提高教學(xué)和科研質(zhì)量，節(jié)省有關(guān)檢驗醫(yī)學(xué)工作者接受繼續(xù)教育的費用和時間，在本刊編委專家們的積極支持下，經(jīng)國家繼續(xù)教育委員會批準(zhǔn)，本刊于2004年起每年開設(shè)繼續(xù)教育(Ⅰ類學(xué)分)欄目，內(nèi)容涉及臨床檢驗和血液學(xué)檢驗、免疫學(xué)檢驗、微生物學(xué)檢驗、生物化學(xué)檢驗、分子生物學(xué)檢驗、實驗室管理等檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù)、新進展。自開設(shè)繼續(xù)教育欄目以來，各地學(xué)員踴躍報名，反應(yīng)熱烈。2015年本刊將繼續(xù)申辦繼續(xù)教育(Ⅰ類學(xué)分)，欲參加者請關(guān)注本刊，具體事宜可與本刊編輯部聯(lián)系。

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Analysis on the in vitro susceptibility test results from two groups of traditional Chinese medicine prescriptions for diabetic foot producing ESBLs Escherichia coli and MRSA

LIANG Xiaoyi，ZHU Haiying，LIU Xiaomei，PAN Min.(Department of Clinical Laboratory，Huatuo Hospital，Guangdong Zhaoqing 526040，China)

ObjectiveTo understand the inhibitory and treatment effects of Coptis chinensis and Coptis chinensis with Musk prescriptions for diabetic foot producing extended－spectrum beta lactamase(ESBLs)Escherichia coli and methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA).MethodsThe patients diagnosed as diabetic foot were enrolled.After culturing，138 isolates of bacteria were isolated，and 67 isolates of ESBLs Escherichia coli and MRSA were screened.The minimum inhibitory concentrations(MIC)of Coptis chinensis(prescription 1)and Coptis chinensis with Musk(prescription 2)were determined by agar dilution method.The treatment effect of the 2 groups of prescriptions for diabetic foot was observed.ResultsThe MIC of prescription 1 for 35 isolates of ESBLs Escherichia coli was≥128 mg/mL，and the MIC of prescription 2 was 32 mg/mL.The MIC scope of prescription 2 was 32－128 mg/mL.The MIC for 32 isolates of MRSA droped from 32 mg/mL(prescription 1)to 8 mg/mL(prescription 2).Compared with prescription 1，the MIC of prescription 2 decreased significantly，the treatment effect was distinct，and the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionsTraditional Chinese medicine prescription Coptis chinensis with Musk has inhibitory and treatment effects for diabetic foot producing ESBLs Escherichia coli and MRSA，which is a novel method for clinical treatment.

Traditional Chinese medicine susceptibility test;Extended－spectrum beta lactamase;Escherichia coli; Methicillin－resistant Staphylococcus aureus;Coptis chinensis;Musk;Diabetic foot

1673－8640(2015)03－0261－04

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.015

2014－04－15)

梁曉誼，女，1974年生，主管技師，主要從事臨床微生物檢驗工作。