兔半月板纖維軟骨細胞的體外去分化研究

付維力 李箭 李棋 唐新 陳剛

四川大學華西醫(yī)院骨科（成都610041）

種子細胞是組織工程半月板和細胞治療的首要因素， 也是保證組織工程半月板進一步深入研究和應用的前提條件[1]。構(gòu)建組織工程半月板和細胞治療需要大量的種子細胞， 目前用于組織工程半月板的種子細胞主要有半月板軟骨細胞、干細胞等[2]；干細胞如骨髓間充質(zhì)干細胞具有多項分化潛能，其細胞來源充足、取材方便、分離培養(yǎng)相對簡單，但其細胞因子調(diào)控和誘導十分復雜并且具有潛在的癌變可能。 自體半月板纖維軟骨細胞是目前種子細胞最佳和應用最廣泛的細胞來源，而分離的原代細胞培養(yǎng)無法滿足細胞數(shù)目的要求，單層培養(yǎng)半月板纖維軟骨細胞是目前用于半月板細胞擴增的最常用手段， 但是在體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞表型可能會出現(xiàn)改變[3]。近年來的研究已確定體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中關節(jié)軟骨和椎間盤軟骨細胞表型隨傳代的進行變?yōu)槌衫w維細胞的表型，表現(xiàn)出去分化的現(xiàn)象[4-6]。但目前對半月板細胞體內(nèi)外生物學特性的認識非常有限， 在單層培養(yǎng)系統(tǒng)中半月板纖維軟骨細胞的表型改變尚不確切[7]。本研究采用機械分離與酶連續(xù)消化相結(jié)合的方法體外分離培養(yǎng)兔半月板纖維軟骨細胞， 單層培養(yǎng)傳代至第5 代，并從形態(tài)學、生長狀況、基質(zhì)蛋白表達水平比較分析體外培養(yǎng)的半月板細胞生物學特性的改變， 為構(gòu)建組織工程半月板和細胞治療中的種子細胞優(yōu)選提供進一步的理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

實驗動物：清潔級健康1 周齡新西蘭乳兔，雌雄不限，體重約200～300 g,由四川大學華西動物實驗中心提供。 1∶1 的DMEM/ F12（DF）、FBS、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型膠原酶、MTT、DMSO(Sigma 公司，美國)，PBS （成都新川化學試劑有限公司），CO2培養(yǎng)箱（SANYO 公司，日本）；離心機（Eppendorf 公司，德國），倒置相差顯微鏡 （Olympus 公司， 日本）， 掃描電鏡（JSM-6700F, JEOL, 日本）, 鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體、鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體原（Oncogene 公司，美國），SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司），DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），酶聯(lián)免疫檢測儀(BIORAD，美國)。

1.2 半月板纖維軟骨細胞的分離培養(yǎng)、傳代

無菌條件下取1 周齡新西蘭乳兔雙膝內(nèi)外側(cè)半月板, 盡量切除附著的滑膜和韌帶，并切除滑膜緣少量半月板組織，放入盛有DF 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用含1%慶大霉素的PBS 沖洗3 遍, 剪成約1 mm3碎塊, 然后0.05%透明質(zhì)酸酶5min 和0.25%胰蛋白酶37 ℃預消化30 min， 再加入0.2%Ⅱ型膠原酶37 ℃恒溫水浴搖床振蕩消化4～6 h。 經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細胞消化下來后用巴氏吸管吹打2 min，終止消化，用200 目篩網(wǎng)過濾消化后的細胞懸液，1.2 kpm 離心5 min， 棄上清，PBS 洗兩次，加入含10% FBS 的DF, 苔盼藍染色測定細胞成活率約90%， 細胞計數(shù)后細胞按1×106/瓶重懸于含10%FBS 的DF 培養(yǎng)基的25 cm2的培養(yǎng)瓶, 置于37 ℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每3 d 換液1次, 隔日倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化和生長情況。 待細胞鋪滿瓶底（80%～90%融合）后, 吸除培養(yǎng)液， 用含0.1% EDTA 的0.25% 胰蛋白酶消化傳代, 倒置相差顯微鏡下見細胞突觸收縮、細胞收縮變圓、細胞間隙增大后吸除消化酶，37 ℃孵育1～2 min。 細胞從瓶壁上脫落后， 加含10% FBS 的DF 培養(yǎng)液吹打混懸終止消化，將細胞懸液按1∶2 比例傳代，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 換液。 隨即傳代至第5 代。 每代細胞懸液按4×104/孔的細胞密度、3 ml 培養(yǎng)液/孔接種于放有24 × 24 血蓋片的六孔板上， 隔日觀察換液，待細胞長滿瓶底取爬片備用。

1.3 形態(tài)學觀察

在倒置顯微鏡下隔日觀察原代至第5 代細胞的大體形態(tài)和生長狀況。取第1 代、第5 代細胞爬片行SEM觀察：經(jīng)2.5%戊二醛固定2 h，酒精梯度脫水，醋酸異戊酯固定置換，CO2臨界點干燥，表面噴金后于SEM 下觀察。

1.4 MTT 法檢測細胞增殖，繪制細胞的生長曲線

取第1～5 代半月板纖維軟骨細胞，分別以含0.1%EDTA 的0.25% 胰蛋白酶消化后，1.2 kpm 離心5 min后收集，加入10% FBS 的DF 培養(yǎng)基，制備密度為2 ×104個/ ml 的細胞懸液， 以每孔200 μl 接種于96 孔板內(nèi)，8 孔為1 組，每代細胞各設5 組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后1、3、5、7、9 d 檢測，檢測時每孔加入20 μl MTT 液后37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除全部液體， 每孔加入50 μl DMSO 振蕩10 min 至結(jié)晶完全溶解，以空白對照孔調(diào)零，在酶標儀上檢測在570 nm 波長處的吸光度（A）值。 以時間為橫坐標、A 值為縱坐標繪制細胞生長曲線， 比較不同代次細胞的生長周期及生長速度。

1.5 細胞化學和免疫組織化學染色

取原代至第5 代半月板細胞爬片行甲苯胺藍、番紅O 染色，免疫組化鑒定細胞分泌的蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白表達情況。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

半月板纖維軟骨細胞原代接種細胞為小圓球形,呈懸浮狀態(tài)，接種后8～12 h 開始貼壁, 48～72 h 大部分細胞貼壁完全, 胞質(zhì)逐漸展開，胞體變大伸長，形成突起，呈多角形。隨著細胞數(shù)量增加，細胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，光滑，胞漿豐富、透亮，折光性強，鏡下觀察有立體感，胞核清晰可見，居中，呈圓形/橢圓形，有多個核仁。 接種5 d 后細胞逐漸融合，7～9 d 后，細胞鋪滿瓶底傳代。 傳代后細胞貼壁生長能力和增殖速度明顯加快，4～6 h 開始貼壁，24 h 貼壁完全，細胞增殖較快，48 h 后開始增殖分裂， 進入對數(shù)生長期，4～6 d 后細胞融合成片狀，出現(xiàn)接觸性抑制。 同時，細胞形成單層、成簇生長，出現(xiàn)明顯的聚集樣分區(qū)，表現(xiàn)出“細胞群集”現(xiàn)象。原代至第2 代半月板軟骨細胞生長迅速，形態(tài)較規(guī)則，多呈多角形，大小均一，細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質(zhì)。 細胞傳至第3 代后，細胞生長緩慢，不規(guī)則細胞逐漸增多， 細胞體積逐漸變大， 形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮?，出現(xiàn)大量的長梭形細胞，呈漩渦狀緊密排列，具有成纖維樣細胞的典型特征。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞活力逐漸下降，生長速度減慢，傳代周期延長，并出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)的細胞。 第5 代細胞分裂相少見， 密度稀疏，細胞形態(tài)不佳，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡和黑色小顆粒，胞核散大，細胞間連接松散，細胞增殖普遍減緩、停滯。 隨著傳代次數(shù)的增加, 細胞中梭形細胞增多,第5 代培養(yǎng)細胞大約80%呈長梭形，分泌和增殖能力下降。 見圖1。

SEM 觀察： 第一代半月板細胞形態(tài)規(guī)則， 呈多極性，表面有突起，立體感強；第5 代細胞胞體變大，形態(tài)不規(guī)則。 見圖2。

圖1 各代次半月板細胞的形態(tài)學觀察（倒置相差顯微鏡，×200）

圖2 第1、5 代半月板細胞掃描電鏡觀察（×400）

2.2 細胞生長曲線

生長曲線（圖3）可見第4 代前半月板細胞生長速度及生長周期均相似，第5 代后細胞生長速度減慢，增殖減緩。

圖3 前5 代半月板細胞生長曲線

2.3 細胞化學和免疫組化染色（圖4）

甲苯胺藍染色：細胞爬片經(jīng)甲苯胺藍染色后，細胞質(zhì)染成淺藍色，細胞核染成深藍色，清晰可見1～3 個核仁。 細胞外基質(zhì)為淺藍色。3 代以后的軟骨細胞逐漸發(fā)生去分化，細胞體積增大，出現(xiàn)許多指狀突起，胞核增大， 隨著傳代次數(shù)增多， 細胞的甲苯胺藍染色逐漸變淺。

番紅O 染色：番紅O 染色主要是對軟骨細胞的蛋白聚糖染色，軟骨細胞胞內(nèi)、胞外含大量蛋白聚糖陽性物質(zhì)被染成紅色，軟骨細胞被包埋于其中，表明有軟骨細胞細胞外基質(zhì)蛋白聚糖分泌。 隨著傳代的進行，蛋白聚糖表達逐漸減弱。

免疫組化：表達呈陽性反應為細胞胞漿呈棕黃色，蘇木素襯染的細胞核呈藍色。 Ⅰ型膠原免疫組化染色可見：至第5 代細胞胞漿內(nèi)陽性反應增強。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，軟骨細胞胞漿被染成棕黃色，細胞相互接觸少的地方棕色較淡， 細胞密集生長的地方棕色較深，并且細胞外也可見到棕色。 說明在培養(yǎng)的軟骨細胞和細胞外基質(zhì)中有Ⅱ型膠原表達， 即可以從細胞中分泌Ⅱ型膠原到細胞外基質(zhì)， 說明培養(yǎng)的細胞具有軟骨細胞的特征。 第1 代后細胞胞漿內(nèi)顯色明顯減弱，且陽性率逐漸降低。

圖4 各代次半月板細胞的細胞化學和免疫組化染色（×200）

3 討論

如何選擇理想的半月板組織工程種子細胞目前仍存在爭議。 目前用于組織工程半月板的種子細胞主要有自體半月板軟骨細胞、干細胞及轉(zhuǎn)基因細胞等[8,9]。干細胞如骨髓間充質(zhì)干細胞具有多項分化潛能， 其細胞來源充足方便、可以大量擴增、分離培養(yǎng)相對簡單，但需要細胞因子刺激誘導轉(zhuǎn)化為纖維軟骨細胞或是在修復過程中首先形成纖維組織再轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維軟骨, 而細胞因子調(diào)控十分復雜，目前對于細胞因子的類型、劑量及其作用機理尚不十分清楚,并具有潛在的癌變可能[10]。 胚胎干細胞具有主動性和無限增殖的能力， 有望成為組織工程半月板種子細胞的新來源， 其應用于臨床的最大問題在于如何有效地誘導其向纖維軟骨細胞定向分化、有效地建立起無免疫原性的胚胎干細胞系、倫理道德方面觀念的制約、致瘤性等。自體半月板纖維軟骨細胞是目前種子細胞最佳和應用最廣泛的細胞來源[11,12]，而分離的原代細胞培養(yǎng)無法滿足細胞數(shù)目的要求，單層培養(yǎng)半月板纖維軟骨細胞是目前用于半月板細胞擴增最常用的手段， 要擴增到理想的細胞數(shù)需要多次傳代,但是在體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞表型可能會出現(xiàn)改變。本研究直接從切除的半月板獲取纖維軟骨細胞, 比較研究不同代次間半月板纖維軟骨細胞基質(zhì)蛋白表達水平和生物學特性的改變， 為構(gòu)建組織工程半月板和細胞治療中的種子細胞優(yōu)選提供了進一步的理論和實踐基礎。 如何使用適當?shù)臈l件作用以促進半月板纖維軟骨細胞有效增殖并維持其表型特征尚需進一步研究。

半月板由半月板細胞和大量的基質(zhì)構(gòu)成， 半月板細胞包埋于基質(zhì)中。半月板細胞外基質(zhì)包括蛋白多糖，組成胞外大分子結(jié)構(gòu)如纖連蛋白和層粘連蛋白的I、III型膠原，軟骨基質(zhì)的II 型膠原[13]。對于將半月板細胞歸類于軟骨細胞還是成纖維細胞，一直存在爭議。 有研究發(fā)現(xiàn)半月板組織包含成纖維細胞樣細胞和軟骨細胞兩種細胞亞型， 因此認為將其稱為纖維軟骨細胞較為合適。形態(tài)學上，半月板細胞在單層培養(yǎng)條件下顯示三種不同的細胞類型[14]：伸長的成纖維細胞樣細胞、多邊形細胞和小圓的軟骨細胞樣細胞。McDevitt 等[14]根據(jù)半月板細胞形態(tài)、 分布和細胞外基質(zhì)的不同將半月板細胞分為不同的細胞亞群：纖維軟骨細胞、成纖維細胞樣細胞和位于淺表層區(qū)的細胞。 纖維軟骨細胞位于半月板內(nèi)側(cè)2/3 和深部， 呈圓形或橢圓形， 有活躍的分泌功能，細胞外基質(zhì)主要為Ⅰ、Ⅱ型膠原，其比例為2∶3，提供半月板的支架結(jié)構(gòu)和拉伸性能[15]，還包括蛋白多糖（半月板主要的蛋白多糖是蛋白聚糖，提供壓縮性能）；成纖維細胞樣細胞位于外周1/3，該區(qū)域含少量細胞外基質(zhì)，主要為Ⅰ型膠原[16]。 Upton 等[17]利用Real-Time PCR 分子技術研究成年豬半月板組織不同區(qū)域ECM蛋白基因表達和鑒定短期（3d）單層培養(yǎng)是否能維持該表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：半月板內(nèi)側(cè)有類似于關節(jié)軟骨基質(zhì)蛋白高水平的mRNA 表達， 包括蛋白聚糖，II 型膠原和NOS-2； 而外側(cè)含有與纖維組織相關聯(lián)的蛋白的高水平mRNA 表達， 包括I 型膠 原、 蛋白酶 MMP2 和MMP3；短期單層培養(yǎng)能維持這些表型。 未來的研究將集中于內(nèi)外側(cè)不同區(qū)域基因表達對損傷、 年齡和環(huán)境刺激因素的生物學改變的意義。 Verdonk 等[18]在不同條件下培養(yǎng)人半月板細胞，并用FCM 分析細胞外基質(zhì)的合成產(chǎn)量和半月板細胞膜標記的表型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：單層培養(yǎng)條件下細胞外基質(zhì)包含較多的Ⅰ、 Ⅱ型膠原和較低的蛋白聚糖，而在海藻酸鈉微珠（水凝膠）條件下培養(yǎng)包含較高的Ⅰ型膠原和蛋白聚糖， 較低的Ⅱ型膠原； 大部分半月板細胞膜標記CD44+CD105+CD34-CD31-，少部分細胞CD34+CD31-主要來源于外周緣半月板有血管區(qū)。 但是這些細胞群準確的細胞表型標記尚不很清楚。

本研究結(jié)果顯示，體外單層培養(yǎng)條件下，隨著傳代的進行，半月板纖維軟骨細胞活力逐漸下降，生長速度減慢，傳代周期延長，逐漸變?yōu)樗笮危螒B(tài)不規(guī)則。體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中， 半月板纖維軟骨細胞表型隨傳代的進行， Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的表達逐漸減少而Ⅰ型膠原表達逐漸增多， 體外單層培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細胞在第5 代開始逐漸失去其特異性表型，發(fā)生去分化，逐漸變?yōu)槌衫w維細胞的表型。 體外單層分離培養(yǎng)的第5 代前的半月板細胞基本維持纖維軟骨細胞的表型和生物學特性， 可作為組織工程半月板的種子細胞。

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