甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的影響

陳秋生，李 近，周滿如，嚴(yán)文健，劉鈺瑜，許衛(wèi)銘

(廣東醫(yī)學(xué)院生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室1、藥理學(xué)教研室2，廣東 湛江524023)

甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的影響

陳秋生1，李 近2，周滿如2，嚴(yán)文健2，劉鈺瑜2，許衛(wèi)銘2

(廣東醫(yī)學(xué)院生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室1、藥理學(xué)教研室2，廣東 湛江524023)

目的觀察甘草酸對體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。方法用傳代貼壁篩選的方法分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。加藥后5 d、7 d、9 d用PNPP法觀察甘草酸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向成骨細(xì)胞方向分化的影響。用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測甘草酸對細(xì)胞骨鈣素(OCN)含量的影響。結(jié)果傳代貼壁篩選的方法可得到骨髓基質(zhì)細(xì)胞，其間存在有間質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后可向成骨細(xì)胞方向分化。甘草酸可以增加大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞堿性磷酸酶和骨鈣素的含量，其中1×10-6mol/L濃度組作用7 d時(shí)效果明顯。結(jié)論甘草酸能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。

甘草酸；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨細(xì)胞；分化

甘草(Glycyrrhiza)為豆科植物甘草、脹果甘草和光果甘草的根及根莖，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，我國中醫(yī)因其具有補(bǔ)脾益氣，清熱祛痰等功效而譽(yù)為上品。甘草中的甘草酸(Glycyrrhizic acid，GA)是其最為重要的活性成分，有文獻(xiàn)報(bào)道它具有對抗炎癥、抗過敏、抗病毒、參與免疫調(diào)節(jié)作用、護(hù)肝、輔助促進(jìn)吸收等功能[1]。研究表明，甘草的干燥根及根莖以及其提取物甘草酸以及其他甘草提取物都有較好的防治骨質(zhì)疏松癥的作用[2-3]。我們課題組前期的預(yù)試也發(fā)現(xiàn)GA和雌激素聯(lián)合應(yīng)用可增加骨羥脯氨酸的含量，增大骨斷裂載荷和最大載荷，改善去卵巢小鼠骨的結(jié)構(gòu)，提升松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)力學(xué)。但目前甘草酸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用的研究較少，本實(shí)驗(yàn)觀察甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖、成骨分化的影響，為研究利用甘草酸防治骨質(zhì)疏松提供更多的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2013年1月至2014年7月。

1 材料與方法

1.1 材料 低糖培養(yǎng)基DMEM和高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(購自Gibco公司)；四硝基苯基磷酸二鈉鹽(PNPP)、L抗壞血酸、β甘油磷酸鈉、地塞米松和甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(購自Sigma公司)；骨鈣素檢測的ELISA試劑盒和堿性磷酸酶染色試劑盒(均購自南京建成生物有限公司)；NAPCO二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(5420-1，Precision Scientific，USA)；XD-101倒置相差顯微鏡(江南光電股份有限公司)；酶標(biāo)儀：Bio-ELX-800型，美國。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離和培養(yǎng)1個(gè)月齡SD大鼠10只，雌雄各半，體重(70±10)g。頸部脫臼后，浸泡于75%酒精，超凈工作臺上無菌分離兩側(cè)的股骨，75%酒精浸泡，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡，去除軟組織后浸泡于低糖的DMEM中，用低糖DMEM沖洗股骨的骨髓腔，將收集沖洗出的細(xì)胞液1000 r/min離心10min后，棄上清液后，用含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培養(yǎng)液以1×107/cm2密度接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后首次半量更換培養(yǎng)液以去除懸浮細(xì)胞，以后每3～4 d全量換液1次，細(xì)胞70%～80%融合后采用胰酶消化傳代。取傳至第3代的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)2次重復(fù)。

1.2.2 成骨誘導(dǎo)方法 成骨誘導(dǎo)組加入成骨誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)液包含β磷酸甘油10mmol/L、抗壞血酸50mg/L、地塞米松1×10-8mol/L。

1.2.3 堿性磷酸酶活性測定(PNPP法) 取96孔板，每孔2×104/cm2密度接種經(jīng)傳3代的MSCs，每孔100 μl。培養(yǎng)48 h后誘導(dǎo)組加入成骨條件培養(yǎng)基，加藥組加入不同濃度的甘草酸，甘草酸終濃度分別為1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L。分別于藥物作用第5天、第7天、第9天測定細(xì)胞堿性磷酸酶含量。測定時(shí)，去掉培養(yǎng)液，PBS沖3遍，按試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測定各孔405 nm波長下的吸光度值(OD405)。

1.2.4 ELISA法檢測骨鈣素(OCN)含量 將經(jīng)傳3代的MSCs消化后，以1×104/cm2細(xì)胞數(shù)加入48孔板，次日加藥，分為空白對照組、成骨誘導(dǎo)組、不同濃度的甘草酸組。每3 d更換一次新鮮的培養(yǎng)液和藥物，收集7 d內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，按ELISA試劑盒說明檢測OCN的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間資料比較采用t檢驗(yàn)。SPSS11.0軟件行方差分析并行Bonferroni組間比較，雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 原代細(xì)胞在鏡下觀察，可看到多種細(xì)胞形態(tài)。24 h后原代取材的細(xì)胞開始貼壁。48 h后，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁展開，出現(xiàn)團(tuán)簇集落。經(jīng)傳代換液的方式純化后的BMSCs細(xì)胞呈均一的長梭形貼底部，局部呈漩渦形整齊排列(圖1)。成骨誘導(dǎo)后用堿性磷酸酶染色后有陽性細(xì)胞，證實(shí)所收集培養(yǎng)的細(xì)胞具有成骨分化能力(圖2)。

圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一般形態(tài)(10×10)

圖2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)成骨誘導(dǎo)后經(jīng)堿性磷酸酶染色的形態(tài)(10×4)

2.2 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 各組間細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.047，P=0.0075)。1×10-4mol/L的甘草酸抑制了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，該濃度組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖抑制率在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后都顯著增高，與空白對照組和成骨誘導(dǎo)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.01，P=0.0101；F=17.83，P=0.0409)，見表1。

表1 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(±s，%)

表1 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(±s，%)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與成骨誘導(dǎo)組比較，bP＜0.05。

組別 增殖抑制率0 h24 h48 h72 h空白對照組成骨誘導(dǎo)組GA1×10-8mol/L GA1×10-7mol/L GA1×10-6mol/L GA1×10-5mol/L GA1×10-4mol/L1.31±0.141.25±0.171.41±0.150.87±0.101.25±0.170.98±0.100.79±0.10ab2.74±0.252.91±0.342.84±0.343.52±0.394.38±0.345.27±0.798.87±1.49ab4.39±0.445.79±0.836.59±0.488.27±0.677.11±0.8310.32±1.2421.46±2.57ab6.71±0.729.85±1.229.01±0.7513.25±1.4311.17±1.2217.85±1.5437.25±3.07ab

2.3 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶含量的影響 成骨誘導(dǎo)組的堿性磷酸酶含量升高，3 d時(shí)與對照組比較有極顯著的升高(P＜0.01)，在第7天達(dá)到高峰，第9天時(shí)開始回落。與對照組比較，1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-5mol/L、和1×10-4mol/L濃度甘草酸無促進(jìn)堿性磷酸酶表達(dá)的作用。1×10-6mol/L濃度的甘草酸可促進(jìn)堿性磷酸酶表達(dá)，作用與成骨誘導(dǎo)組相當(dāng)。堿性磷酸酶含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長而逐漸升高，在第7天達(dá)到高峰，第9天開始回落。其中1×10-6mol/L濃度的甘草酸作用7 d，藥物促進(jìn)堿性磷酸酶表達(dá)的作用最明顯(F=4.311，P=0.0083)，見表2。

表2 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶含量的影響(±s，mol/L)

表2 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶含量的影響(±s，mol/L)

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別 堿性磷酸酶含量0 d3 d7 d9 d空白對照組成骨誘導(dǎo)組GA1×10-8mol/L GA1×10-7mol/L GA1×10-6mol/L GA1×10-5mol/L GA1×10-4mol/L0.2±0.020.01±0.010.01±0.020.01±0.020.01±0.03b0.01±0.010.01±0.010.3±0.030.48±0.020.25±0.030.27±0.030.51±0.04b0.29±0.020.23±0.020.45±0.050.69±0.030.46±0.040.49±0.030.68±0.04b0.51±0.030.44±0.030.42±0.040.5±0.040.44±0.040.44±0.050.63±0.05b0.43±0.050.38±0.05

2.4 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣素含量的影響 和對照組比較，成骨誘導(dǎo)組的骨鈣素含量升高(P＜0.01)而且呈持續(xù)增高。與空白對照組比較，1×10-8mol/L、1×10-7mol/L和1×10-4mol/L濃度甘草酸沒有促進(jìn)骨鈣素濃度增高。1×10-6mol/L和1×10-5mol/L濃度的甘草酸可促進(jìn)骨鈣素表達(dá)，作用與成骨誘導(dǎo)組相當(dāng)。隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，骨鈣素含量逐漸升高。其中1×10-5mol/L濃度的甘草酸作用最明顯(F=2.900，P=0.043)，見表3。

表3 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣素含量的影響(±s，mol/L)

表3 甘草酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣素含量的影響(±s，mol/L)

分組 鈣素含量0 d3 d7 d9 d空白對照組成骨誘導(dǎo)組GA1×10-8mol/L GA1×10-7mol/L GA1×10-6mol/L GA1×10-5mol/L GA1×10-4mol/L0.3±0.030.32±0.030.28±0.020.28±0.020.33±0.020.29±0.030.31±0.031.19±0.151.69±0.181.28±0.121.37±0.121.83±0.191.89±0.21.48±0.121.35±0.112.01±0.211.39±0.131.49±0.132.17±0.222.2±0.241.59±0.191.51±0.192.17±0.231.58±0.181.69±0.182.34±0.282.4±0.271.75±0.21

3 討論

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是一種主要特征為骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化，從而導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加而易發(fā)生骨折的全身性代謝骨病。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)高速發(fā)展，人民預(yù)期壽命獲得大幅延長。但也因此，骨質(zhì)疏松癥也日漸成為常見病種而引起臨床重視[4]，如何預(yù)防和治療也成為骨相關(guān)學(xué)科的研究重點(diǎn)。能否從細(xì)胞水平研發(fā)藥物，促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松過程，成為了防治骨質(zhì)疏松癥的較有前途的方法之一。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是成人體內(nèi)具有多向分化潛能的干細(xì)胞，它位于骨髓結(jié)締組織中。MSC可在不同誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞[5]。如果MSC向成骨分化減弱或者向成脂分化增強(qiáng)都會導(dǎo)致人體內(nèi)骨量的減低，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥。因此，如何逆轉(zhuǎn)這一過程，研發(fā)增強(qiáng)MSC向成骨轉(zhuǎn)化的藥物，已成為干細(xì)胞骨轉(zhuǎn)化相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥治療領(lǐng)域的目標(biāo)。

如前言所述，甘草酸作為甘草重要成份，對骨代謝的影響及治療作用日益受到重視。本課題組發(fā)現(xiàn)，在甘草酸對抗小鼠肝纖維化及骨丟失的實(shí)驗(yàn)中，一定劑量的甘草酸可增加四氯化碳小鼠模型的骨量和骨鈣，骨羥脯氨酸含量也同時(shí)增高3倍以上[6-7]。這說明甘草酸具有促成骨細(xì)胞生長以及分泌的功能，調(diào)控骨組織中的微量元素的含量，從而發(fā)揮抗肝纖維所致的骨質(zhì)丟失。相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道，甘草酸具有改善關(guān)節(jié)、修復(fù)骨膜損傷的功能[8]。此外，它還協(xié)助癸酸鈉促進(jìn)細(xì)胞吸收降鈣素，從而抑制骨吸收[9]。其作用機(jī)制是降低上皮細(xì)胞膜兩側(cè)的電阻，增強(qiáng)結(jié)腸吸收降鈣素能力，從而提高藥物的生物利用度，使骨吸收和骨重建達(dá)到平衡狀態(tài)。去卵巢小鼠以甘草酸聯(lián)合雌激素處理后其第四腰椎最大載荷顯著增強(qiáng)[10]。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道老年性骨質(zhì)疏松可以甘草附子湯等中醫(yī)治療[11-12]。這些均表明單獨(dú)使用甘草酸或與雌激素聯(lián)用可能有助于治療骨質(zhì)疏松癥。但是甘草酸在成骨分化方面的詳細(xì)作用及機(jī)制、以及其在骨質(zhì)疏松模型動物的詳細(xì)作用機(jī)制仍待闡明。

本研究聚焦于在細(xì)胞以及分子水平方面，甘草酸促成骨的詳細(xì)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示甘草酸具有促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化的作用。1×10-6mol/L的濃度可提高堿性磷酸酶活性。同時(shí)該濃度既可促進(jìn)堿性磷酸酶表達(dá)，也可促進(jìn)骨鈣素的分泌。成骨細(xì)胞早期發(fā)育階段特異性標(biāo)志物就是堿性磷酸酶。它可抑制骨礦化過程中的無機(jī)焦磷酸鹽向無機(jī)磷水解，在細(xì)胞外基質(zhì)礦化中起關(guān)鍵作用。它的活性高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀態(tài)。而成骨細(xì)胞晚期發(fā)育階段的標(biāo)志物則是骨鈣素，同時(shí)它也是骨中最豐富的非膠原蛋白[13]。我們的研究結(jié)果說明，加入甘草酸后，MSC的堿性磷酸酶和骨鈣素的表達(dá)出現(xiàn)顯著提高。這說明甘草酸在MSC的成骨分化過程的早期和晚期，也就是骨分化的全過程均有一定的促進(jìn)作用。而這也是甘草酸拮抗骨質(zhì)疏松的可能作用機(jī)制。

甘草及甘草甜素的一系列風(fēng)險(xiǎn)及安全評估結(jié)果均表明甘草并無潛在的致畸、致突變等遺傳毒性。美國FDA、國際衛(wèi)生和糧農(nóng)組織食品添加劑法規(guī)委員會等機(jī)構(gòu)也均認(rèn)為甘草和甘草提取物、如甘草甜素等屬于安全無毒物質(zhì)。鑒于甘草酸幾乎沒有毒副作用，而我們的研究結(jié)果也表明其具有抗骨質(zhì)疏松作用，它有望開發(fā)為高效低毒的抗骨質(zhì)疏松藥物，將造福廣大骨質(zhì)疏松患者。

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Effect of glycyrrhizic acid on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.

CHEN Qiu-sheng1,LI Jin2,ZHOU Man-ru2,YAN Wen-jian2,LIU Yu-yu2,XU Wei-ming2.Laboratory of Physiological Science1,Department of Pharmacology2,Guangdong Medical College,Zhanjiang524023,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of glycyrrhizic acid on proliferation and differentiation of cultured rat bone marrow mesenchymal stem cell.MethodsRat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified.On the5th,7th,9thday after medication,PNPP method was used to study the effects of glycyrrhizic acid on alkaline phosphatase,and ELISA was used to detect the effects of glycyrrhizic acid on osteocalcin secretion.ResultsBone marrow stromal cells were obtained through culture,in which the mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts.Glycyrrhizic acid could increase the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in rat bone marrow mesenchymal stem cells after osteogenic induction,and the effect was the most significant in cells treated with1×10-6mol/L glycyrrhizic acid for7 days.ConclusionGlycyrrhizic acid can promote rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts.

Glycyrrhizic acid;Bone marrow mesenchymal stem cells;Osteoblasts;Differentiation

R-332

A

1003—6350（2015）22—3281—03

2015-04-14)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.22.1192

湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：2012C3106021）；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：1057112016）

許衛(wèi)銘。E-mail：642081529@qq.com