牙周炎對(duì)慢性細(xì)菌性前列腺炎大鼠前列腺的影響

劉城城，韓廣瑋，陳江川，易善紅，馮小倩 (.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院泌尿外科，重慶400037;.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科，重慶400037)

慢性細(xì)菌性前列腺炎(chronic bacterial prostatitis，CBP)是前列腺被病原體持續(xù)或反復(fù)感染的一種下尿路感染［1］。近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升，是泌尿外科臨床工作中常見(jiàn)的感染性疾?。?］。牙周炎(periodontitis，PE)是由多種微生物引起的感染性疾病，其導(dǎo)致牙周支持組織破壞、結(jié)締組織附著喪失、牙周袋形成，以及牙槽骨吸收，最終以牙齒松動(dòng)和缺失為結(jié)局［3］，其發(fā)病率高達(dá)60%～70%［4］。研究發(fā)現(xiàn)，中重度前列腺炎合并牙周附著喪失(clinical attachment loss，CAL)大于等于2.7 mm的受試者前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)水平高于中重度前列腺炎合并CAL 小于2.7 mm的受試者以及無(wú)/輕度前列腺炎合并CAL 小于2.7 mm 或CAL 大于等于2.7 mm 的受試者［5］。這表明牙周炎與CBP 之間可能存在一種聯(lián)系，如同腮腺炎引起睪丸炎或者牙周炎與糖尿病之間的雙向性關(guān)系［6-8］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)復(fù)制CBP 及牙周炎大鼠模型，觀察牙周炎對(duì)CBP 大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)改變及炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

采用標(biāo)準(zhǔn)致病大腸埃希菌(ATCC25922)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，以比濁法用無(wú)菌生理鹽水配成1.5 ×108/mL 濃度菌液，恒溫震蕩搖床(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，3%戊巴比妥鈉(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，10%甲醛溶液(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，光學(xué)顯微鏡(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，直徑0.2 mm 的口腔正畸結(jié)扎鋼絲(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科提供)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

成年遠(yuǎn)交群(sprague dawley，SD)大鼠80 只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量220 ～250 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用抽簽法分為4 周組及8 周組，每組各40 只，4 周組及8 周組再采用抽簽法每組均分為空白對(duì)照組(N 組)、慢性細(xì)菌性前列腺炎組(CBP 組)、牙周炎組(PE 組)、慢性細(xì)菌性前列腺炎+牙周炎組(CBP+PE 組)，每組各10 只。

1.3 動(dòng)物模型的建立方法

慢性細(xì)菌性前列腺炎模型［9］的建立:3% 戊巴比妥鈉(20 mg/kg)用1 mL 無(wú)菌注射器腹腔注射，與大鼠腹部皮膚呈斜角30°進(jìn)針，回抽無(wú)液體后將3%戊巴比妥鈉注入大鼠腹腔，妥善麻醉后，固定頭部及四肢，備大鼠下腹部皮膚，常規(guī)消毒鋪巾，取大鼠下腹部1.5 ～2 cm 切口，嚴(yán)格無(wú)菌操作，無(wú)齒鑷提起膀胱，暴露前列腺兩葉，用1 mL 無(wú)菌注射器將濃度為1.5 ×108/mL 菌液注射入前列腺背側(cè)各0.1 mL，N 組注入等量無(wú)菌生理鹽水。逐層關(guān)閉切口，縫皮前用碘伏消毒皮膚。完畢后送回動(dòng)物房，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

牙周炎模型［10］的建立:按慢性細(xì)菌性前列腺炎模型方法麻醉大鼠，妥善麻醉后，固定頭部及四肢，無(wú)齒鑷撐開(kāi)口腔，用口腔正畸結(jié)扎鋼絲(直徑0.2 mm)結(jié)扎右上頜第一磨牙牙頸部。完畢后送回動(dòng)物房，每天高糖飲食喂養(yǎng)(飲用水為10%葡萄糖水，飼料為10%葡萄糖水浸泡變軟的常規(guī)飼料)。

將大鼠喂養(yǎng)4 周后，腹腔注射過(guò)量3%戊巴比妥鈉處死4周組所有大鼠，于大鼠麻醉但未死時(shí)測(cè)量大鼠口腔各項(xiàng)指標(biāo)，打開(kāi)腹腔，取出大鼠前列腺組織，大鼠死后取頭顱去肉存骨10%甲醛溶液保存右上頜骨。每份前列腺組織分為2 份，1 份放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，HE 染色;另外1 份放入凍存管于-80 ℃冰箱保存。于大鼠喂養(yǎng)8 周后按上述方法處理所有8 周組大鼠。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 石蠟切片 10%福爾馬林溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，并用HE 染色，每個(gè)標(biāo)本切8 張切片，切片厚度為5 μm，光鏡下觀察大鼠的前列腺組織中的腺體、導(dǎo)管和間質(zhì)的變化。根據(jù)Bahk 等［11］方法計(jì)算石蠟切片中的病理得分:每張切片中隨機(jī)取5 個(gè)高倍視野，計(jì)算鏡下視野中病變部位與整個(gè)視野的面積之比，無(wú)病變計(jì)0 分，25%的計(jì)1 分，50%計(jì)2 分，75%計(jì)3 分，100%計(jì)4 分。

1.4.2 牙周各項(xiàng)指標(biāo) 探出血指數(shù)，檢查使用鈍頭探針。0 表示牙齦健康;1 表示牙齦輕度炎癥，表現(xiàn)為顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血;2 表示牙齦中等炎癥，表現(xiàn)為色紅，水腫光亮，探診出血;3 表示嚴(yán)重炎癥:牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動(dòng)出血傾向。牙周袋深度:用細(xì)刻度探針探選用牙牙周袋，每牙選近中頰、頰側(cè)、遠(yuǎn)中頰3 個(gè)點(diǎn)測(cè)量，取均值。附著喪失:測(cè)量牙周袋深度后，當(dāng)探針尖沿牙根面退出時(shí)，探尋釉牙骨質(zhì)界位置，測(cè)得釉牙骨質(zhì)界到齦緣的距離，將袋深度減去該距離即為附著喪失的程度。牙槽骨吸收值:測(cè)量從釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)拈L(zhǎng)度，每牙選近中頰、頰側(cè)、遠(yuǎn)中頰3 個(gè)點(diǎn)，取均值。

1.4.3 TNF-α 和IL-1β 的檢測(cè) 取出凍存前列腺組織，剪下一塊前列腺組織，其余放-80 ℃冰箱保存，剪碎取下的組織按每100 mg 前列腺組織加入無(wú)菌生理鹽水1 mL 的比例，將無(wú)菌生理鹽水和剪碎的前列腺組織加入小燒瓶，將小燒瓶放入冰水浴中，然后用勻漿器攪拌充分制成勻漿(注意攪拌時(shí)要間斷暫停，以防止勻漿過(guò)熱變性)。將攪拌好的勻漿吸取加入離心試管中，3 000 r/min 離心10 min，取勻漿上清液。采用雙抗體夾心ELISA 法定量分析各組大鼠前列腺中TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)，ELISA 試劑盒購(gòu)于BOSTER 公司，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組前列腺病理情況

4 周和8 周的N 組、PE 組大鼠前列腺皺襞較多，腔隙大小不一，間質(zhì)內(nèi)少量結(jié)締組織及纖維結(jié)締組織，無(wú)淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生(圖1a、b、e、f)。4 周和8 周的CBP、CBP+PE 組可見(jiàn)前列腺腺上皮增生、腺體腫脹擴(kuò)張，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腺腔及間質(zhì)，纖維組織增生，大體呈現(xiàn)慢性細(xì)菌性前列腺炎改變(圖1c、d、g、h)。8 周CBP、CBP+PE 組前列腺雖然呈現(xiàn)慢性炎癥改變，但是與4 周CBP、CBP+PE 組比較可見(jiàn)腺上皮及纖維組織增生有所改善，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

2.2 前列腺炎癥評(píng)分

各組前列腺炎癥評(píng)分如表1 所示，無(wú)論是在4 周組還是8周組中，CBP + PE 組和CBP 組炎癥評(píng)分均較N 組、PE 組高(P ＜0.05)，其中4 周和8 周的PE 組和N 組之間以及4 周CBP+PE組和4 周CBP 組之間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，8 周CBP+PE 組高于8 周CBP 組(P ＜0.05)，4 周CBP+PE、CBP 組較8 周CBP+PE、CBP 組高(P ＜0.05)。

2.3 前列腺中TNF-α 和IL-1β 水平

各組TNF-α 和IL-1β 如表2 所示，CBP+PE 組、CBP 組較N組和PE 組高(P ＜0.05)，其中PE 組和N 組之間以及4 周CBP+PE、CBP 組之間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，8 周CBP+PE 組高于8 周CBP 組(P ＜0.05)，4 周CBP + PE、CBP 組較8 周CBP+PE、CBP 組高(P ＜0.05)。

2.4 牙周各項(xiàng)指標(biāo)

各組大鼠牙周各項(xiàng)指標(biāo)如表3 所示，PE 組及CBP +PE 組較N 組及CBP 組高(P ＜0.05)，其中PE 組與CBP +PE 組之間、N 組與CBP 組之間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，8 周N 組及CBP組與4 周N 組及CBP 組之間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，但是8 周PE 組及CBP+PE 組牙周各項(xiàng)指標(biāo)高于4 周PE 組及CBP+PE組(P ＜0.05)。

圖1 各組大鼠前列腺病理切片光鏡觀察(HE ×100)

表1 各組大鼠前列腺炎癥評(píng)分(±s，n=80)

表1 各組大鼠前列腺炎癥評(píng)分(±s，n=80)

* :與N、PE 組比較，P ＜0.05;#:4 周與8 周比較，P ＜0.05;△:CBP+PE 組與CBP 組比較，P ＜0.05

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表2 各組大鼠前列腺TNF-α、IL-1β 水平(±s，n=80，pg/mL)

表2 各組大鼠前列腺TNF-α、IL-1β 水平(±s，n=80，pg/mL)

* :與N、PE 組比較，P ＜0.05;#:與8 周比較，P ＜0.05;△:與CBP 組比較，P ＜0.05

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表3 各組大鼠牙周各項(xiàng)指標(biāo)(±s，n=80)

表3 各組大鼠牙周各項(xiàng)指標(biāo)(±s，n=80)

* :與N、CBP 組比較，P ＜0.05;#:與4 周相應(yīng)組比較，P ＜0.05

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3 討論

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是男性中青年的常見(jiàn)病，是我國(guó)發(fā)病率較高的男性生殖系統(tǒng)感染性疾病之一，占泌尿外科男性門診患者的25% ～30%［12］。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)將前列腺炎分為4 型，Ⅱ型為慢性細(xì)菌性前列腺(chronic bacterial prostatitis，CBP)［13］。由于前列腺特殊的生理及解剖特點(diǎn)，導(dǎo)致其臨床表現(xiàn)多樣化，主要表現(xiàn)為會(huì)陰部、盆骨區(qū)域、腰骶部等部位的疼痛，排尿功能障礙伴感覺(jué)異常癥狀，如尿頻、尿急、尿痛、排尿燒灼感、排尿困難，性功能障礙如陽(yáng)痿、早泄、勃起功能障礙等［14］。慢性前列腺炎患者精漿細(xì)菌培養(yǎng)有80%的感染病例可以培養(yǎng)出大腸埃希菌，其余為變形桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等［15］，并且在最近的研究中發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌亦能引起慢性前列腺炎［16］。

牙周炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，它涉及到一系列的免疫反應(yīng)與炎癥過(guò)程。目前對(duì)牙周炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要是:菌斑及其產(chǎn)物細(xì)菌內(nèi)毒素和細(xì)菌酶可直接損傷牙周上皮和結(jié)締組織，引發(fā)牙周組織初期炎癥，導(dǎo)致牙齦的腫脹和炎癥，菌斑激活的宿主細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，同時(shí)激活了宿主防御細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α、白介素1β 等，這些產(chǎn)物導(dǎo)致了牙周組織的繼發(fā)損傷，其引起的炎癥反應(yīng)擴(kuò)大到深部組織引發(fā)牙周袋形成、附著喪失和牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙周組織的降解和破壞［17］。

慢性細(xì)菌性前列腺炎與牙周炎在發(fā)病機(jī)制方面細(xì)菌及其產(chǎn)物是必須的始動(dòng)因子，而炎癥細(xì)胞因子、免疫反應(yīng)、精神心理因素、鋅含量下降、氧化應(yīng)激反應(yīng)等能進(jìn)一步加重CBP。有文獻(xiàn)報(bào)道［18-20］，細(xì)菌及其產(chǎn)物引發(fā)牙周炎后，牙周炎亦能通過(guò)炎癥細(xì)胞因子、免疫反應(yīng)、精神心理因素、鋅含量下降等方面加重。本研究選取N 組、PE 組、CBP 組及CBP +PE 組4 組動(dòng)物模型，通過(guò)比較4 周及8 周兩個(gè)時(shí)間段的各個(gè)模型組之間前列腺組織病理形態(tài)學(xué)改變、炎癥評(píng)分、TNF-α、IL-1β 的含量及牙周各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PE 組、N 組之間在前列腺炎癥評(píng)分、TNF-α、IL-1β 這3 項(xiàng)預(yù)示前列腺炎癥的指標(biāo)無(wú)明顯差異，且低于CBP 組，由此我們認(rèn)為單純的牙周炎并不能如腮腺炎引起睪丸炎一樣直接誘發(fā)慢性細(xì)菌性前列腺炎。通過(guò)4 周CBP 組和8 周CBP組之間前列腺炎癥評(píng)分、TNF-α、IL-1β 的比較我們發(fā)現(xiàn)大鼠前列腺在4 周時(shí)呈現(xiàn)典型的慢性炎癥改變而8周時(shí)前列腺的慢性炎癥改變較4 周明顯減輕，這表明大鼠慢性細(xì)菌性前列腺炎模型在長(zhǎng)時(shí)間段的喂養(yǎng)中前列腺的炎癥呈自愈改變，然后在8 周CBP 組和8 周CBP+PE 組之間前列腺炎癥評(píng)分、TNF-α、IL-1β 的比較中，8 周CBP +PE 組明顯高于8 周CBP 組，這預(yù)示著8 周CBP + PE 組大鼠前列腺炎癥程度高于8 周CBP 組大鼠，即牙周炎與慢性細(xì)菌性前列腺炎之間的關(guān)系如牙周炎與糖尿病之間的關(guān)系一樣是一種雙向性聯(lián)系，牙周炎能使慢性細(xì)菌性前列腺炎大鼠前列腺的自愈能力下降并維持其炎癥狀態(tài)。

通過(guò)對(duì)上述各時(shí)間段各模型組各項(xiàng)觀察指標(biāo)的比較我們總結(jié)出以下幾點(diǎn):①單純牙周炎無(wú)法如腮腺炎引起睪丸炎一樣在大鼠模型上引起慢性細(xì)菌性前列腺炎;②慢性細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型在長(zhǎng)時(shí)間段的觀察中呈現(xiàn)自愈傾向;③慢性細(xì)菌性前列腺炎長(zhǎng)時(shí)間合并牙周炎，在大鼠模型上能抑制大鼠慢性細(xì)菌性前列腺炎的自愈傾向使其保持在慢性炎癥階段。故我們推測(cè)牙周炎與慢性細(xì)菌性前列腺炎之間呈現(xiàn)了一種雙向性關(guān)系，而這種關(guān)系在細(xì)胞水平是如何作用的，并且對(duì)牙周炎的治療能否改善慢性細(xì)菌性前列腺炎仍需要進(jìn)一步研究。

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