武文麗,顏家保,紀南南,曹曉詩,胡茜茜,吳 優(yōu)
(武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430081)
煉油廢水中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選
武文麗,顏家保,紀南南,曹曉詩,胡茜茜,吳 優(yōu)
(武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430081)
從煉油廢水活性污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6。對篩選菌株進行了生理生化實驗和菌種鑒定,考察了碳源種類、培養(yǎng)基的m(C)∶m(N)、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響;并對其NH3-N去除性能進行了考察。經(jīng)鑒定,該菌為鮑曼不動桿菌,適宜的培養(yǎng)條件為:以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH 9.0、m(C)∶m(N)=10、接種量2.0%。在此條件下培養(yǎng)20 h,可將NH3-N質(zhì)量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L,平均NH3-N去除速率為11.79 mg/(L·h)。WY6菌可在32 h內(nèi)將實際煉油廢水的NH3-N質(zhì)量濃度由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L,NH3-N去除率達98.4%,表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
煉油廢水;氨氮;異養(yǎng)硝化-好氧反硝化;菌種篩選
煉油廢水含有烴類化合物及其衍生物、酚類、雜環(huán)化合物、硫化物和氨氮等多種污染物,廢水量大,組分復(fù)雜,難降解有機物多,COD含量較高[1]。煉油廢水一般采用隔油—氣浮—生化的處理工藝[2],COD去除效果較好,但廢水中NH3-N的脫除效果常常不穩(wěn)定,生化過程硝化率低,造成生化后出水ρ(NH3-N)超標,不得不增加生物接觸氧化池和生物曝氣濾池等裝置進一步處理,提高了廢水的處理成本。煉油廢水生物處理系統(tǒng)的硝化率較低有多方面原因,最主要的可能是某些毒性有機物對自養(yǎng)硝化菌的抑制。而異養(yǎng)硝化菌能利用有機碳源,可消除有機物的抑制作用,從而提高煉油廢水的硝化效果,并達到同時脫碳脫氮的目的。
本工作從煉油廢水生物處理活性污泥中分離得到異養(yǎng)硝化-好氧反硝化高效菌,對篩選菌株進行了生理生化實驗和菌種鑒定,考察了碳源種類、培養(yǎng)基的m(C)∶m(N)、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響;并對其NH3-N去除性能進行了考察,旨在為煉油廢水的新型生物脫氮技術(shù)提供依據(jù)。
1.1 材料和儀器
活性污泥:取自中國石化武漢分公司煉油廢水生化處理裝置。
LB培養(yǎng)基:酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,蛋白胨10 g,pH=7.1~7.5,加蒸餾水定容至1 L。
異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基:丁二酸鈉9.54 g,Na2HPO4·12H2O 8.0 g,KH2PO41.5 g,(NH4)2SO41.0 g,MgSO40.1 g,F(xiàn)eSO40.01 g,微量元素儲備液2 mL,pH=7.0~7.3,用蒸餾水定容至1 L。
微量元素儲備液:組成見文獻[3]。
反硝化培養(yǎng)基:用0.15 g KNO3替代(NH4)2SO4,其余組分同異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基。
實際廢水:中國石化武漢分公司排水車間氣浮隔油后的煉油廢水,COD=600~800 mg/L,ρ(NH3-N)=60~80 mg/L,pH=8~9。
所用試劑除酵母提取物、蛋白胨外,其余均為分析純。
SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱:上海博訊實業(yè)有限公司;QYC21型恒溫搖床:上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;752N型紫外-可見分光光度計:上海儀電分析儀器有限公司;1-14型小型離心機:德國SIGMA公司。SA3500-85型雙目顯微鏡:北京泰克儀器有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的富集和篩選
取少量活性污泥接種于LB培養(yǎng)基中活化,然后轉(zhuǎn)接至異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中多次馴化,對馴化后的菌液進行梯度稀釋,采用平板劃線法進行純化,得到異養(yǎng)硝化菌株;對篩選出的菌株進行硝化性能測試,將硝化能力較好的菌株再接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中多次馴化,再經(jīng)分離純化得到同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的菌株。
1.2.2 菌種鑒定
選取篩選得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能最好的一株細菌作為高效菌,進行菌種鑒定和特性研究:依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]進行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗;用溶菌酶-CTAB-蛋白酶K法[5]提取DNA,委托北京鼎國生物技術(shù)有限公司進行16S rDNA序列分析。
1.2.3 培養(yǎng)條件的選擇
將篩選所得高效菌接入LB培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期的菌液離心,收集菌體,再用無菌水洗滌2次,然后將菌體重懸浮于無菌水中,調(diào)節(jié)菌體濃度,使菌液于600 nm處的光密度約等于1,制成菌懸液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
將菌懸液按一定接種量(φ,%)接種至以NH3-N為唯一氮源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中,ρ(NH3-N)=212.02 mg/L,在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng),分別考察碳源種類、m(C)∶m(N)、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響。
1.2.4 煉油廢水中NH3-N的降解
將篩選得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌按一定接種量接種于100 mL氣浮后的實際煉油廢水中,考察菌株在最佳培養(yǎng)條件下對實際廢水中NH3-N的去除效果。
1.3 分析方法
細菌生長量采用光密度法測定[6];ρ(NH3-N)采用納氏試劑分光光度法測定[7]。
2.1 菌種鑒定
經(jīng)分離純化,獲得12株同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的菌株。選取1株硝化和反硝化綜合性能最好的菌株(命名為WY6)進行研究。在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上,WY6菌落呈乳白色,圓形,中間凸起,表面光滑濕潤,邊緣整齊,無水溶性色素產(chǎn)生,革蘭氏染色呈陰性。該菌不能水解淀粉和明膠,產(chǎn)生H2S;甲基紅反應(yīng)呈陽性,而二乙酰反應(yīng)、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產(chǎn)酸實驗呈陰性。WY6菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色菌體的顯微鏡照片見圖1。
菌株WY6通過16S rDNA測序后,將所得堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對,并用MEGA 5.0軟件計算序列的系統(tǒng)進化距離,構(gòu)建菌株WY6的系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖2。由圖2可見,在進化過程中與菌株WY6親緣關(guān)系最近的均為鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)。結(jié)合WY6的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征,將其鑒定為鮑曼不動桿菌。
圖1 WY6菌的菌落形態(tài)(a)和革蘭氏染色菌體(b)的顯微鏡照片
圖2 菌株WY6的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2 培養(yǎng)條件
2.2.1 碳源
WY6為異養(yǎng)硝化菌,可以利用培養(yǎng)基或廢水中的有機碳源。在m(C)∶m(N)=8、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下,將WY6分別接種至以葡萄糖、蔗糖、乳糖、丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中,考察碳源種類對NH3-N去除效果的影響。碳源種類對ρ(NH3-N)的影響見圖3。由圖3可見:分別以丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源時,ρ(NH3-N)下降速率最快,以蔗糖為碳源時居中,以葡萄糖、乳糖為碳源時最慢;當(dāng)以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)時間為26 h時,ρ(NH3-N)由212.02 mg/L 降至8.52 mg/L。這可能是因為WY6菌能直接利用丁二酸鈉和檸檬酸鈉,而以葡萄糖、乳糖為碳源時,還原性糖與氨類物質(zhì)在高壓蒸汽滅菌時會在高溫條件下發(fā)生美拉德反應(yīng),部分生成難以利用的大分子物質(zhì)的緣故[8]。因此,WY6菌適宜的碳源為丁二酸鈉,這與陳趙芳等[9-10]的研究結(jié)果類似。
圖3 碳源種類對ρ(NH3-N)的影響
2.2.2 m(C)∶m(N)
Joo等[11]的研究結(jié)果表明,m(C)∶m(N) 是影響異養(yǎng)硝化菌NH3-N去除效果的重要因素。在以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下,m(C)∶m(N)對ρ(NH3-N)的影響見圖4。由圖4可見:m(C)∶m(N)越高,NH3-N去除效果越好,反之則越差;當(dāng)m(C)∶m(N)大于10時,3條ρ(NH3-N)去除曲線幾乎重合。說明有機碳源是WY6菌生長的限制性因素,碳源越豐富越有利于NH3-N的去除。因此在后續(xù)實驗中,m(C)∶m(N)取為10。
圖4 m(C)∶m(N)對ρ(NH3-N)的影響
2.2.3 培養(yǎng)溫度
培養(yǎng)溫度主要影響微生物酶的活性,從而影響其生長和代謝[12]。在以丁二酸鈉為碳源、m(C)∶m(N)=10、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下,培養(yǎng)溫度對ρ(NH3-N)的影響見圖5。
圖5 培養(yǎng)溫度對ρ(NH3-N)的影響
由圖5可見:培養(yǎng)溫度為20~30 ℃時,隨培養(yǎng)溫度的升高,NH3-N去除效果變好;當(dāng)培養(yǎng)溫度進一步升高至37 ℃時,NH3-N去除效果變差。這可能是由于酶的活性受到一些抑制,使NH3-N的去除速率放緩。由此可見,WY6菌適宜的培養(yǎng)溫度為30 ℃。
2.2.4 接種量
接種量的大小影響細菌在培養(yǎng)基中的生長繁殖速率,采用較大的接種量可以縮短細菌達到對數(shù)生長期的時間,但接種量過大容易引起溶氧不足,而且也不經(jīng)濟;相反,接種量過小則會延長細菌的延滯期。在以丁二酸鈉為碳源、m(C)∶m(N)= 10、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1的條件下,接種量對ρ(NH3-N)的影響見圖6。由圖6可見,接種量在2.0%~10.0%范圍內(nèi)的NH3-N去除效果相差不大??紤]到方法的經(jīng)濟性,將WY6菌接種量定為2.0%。
圖6 接種量對ρ(NH3-N)的影響
2.2.5 初始pH的影響
溶液酸堿度是影響硝化作用的重要因素[13]。在以丁二酸鈉為碳源、m(C)∶m(N)=10、培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量為2.0%的條件下,初始pH對ρ(NH3-N)的影響見圖7。
圖7 初始pH對ρ(NH3-N)的影響
由圖7可見:初始pH在4.0~9.0范圍內(nèi)時,提高初始pH可加快NH3-N的去除,即弱堿性區(qū)間內(nèi)的NH3-N去除速率較中性及弱酸性區(qū)間快,這是由于弱酸性不利于細菌的生長,導(dǎo)致NH3-N的去除速率緩慢;在初始pH為9.0、培養(yǎng)時間為20 h時,ρ(NH3-N)由245.46 mg/L 降至9.71 mg/L,平均NH3-N去除速率為11.79 mg/(L·h)。實驗結(jié)果表明,WY6菌適宜的初始pH與實際廢水的pH較為接近,方便該菌的實際應(yīng)用。
2.3 WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果
在最佳條件下,WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果見圖8。由圖8可見:WY6菌能很快適應(yīng)實際廢水環(huán)境,且接種量為0.5%和2.0%時NH3-N的去除效果相當(dāng);當(dāng)接種量為0.5%時,煉油廢水經(jīng)32 h處理后,ρ(NH3-N)由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L,NH3-N去除率達98.4%。該菌表現(xiàn)出良好的硝化能力和潛在的應(yīng)用前景。
圖8 WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果
a)通過硝化培養(yǎng)基富集、馴化,從煉油活性污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6,經(jīng)鑒定為鮑曼不動桿菌。
b)菌株WY6的適宜培養(yǎng)條件為:以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 9.0、培養(yǎng)基的m(C)∶m(N)=10、接種量2.0%。在此條件下培養(yǎng)20 h,可將NH3-N質(zhì)量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L,NH3-N平均去除速率為11.79 mg/(L·h)。
c)WY6菌對實際煉油廢水具有良好的NH3-N去除能力,可在32 h內(nèi)將NH3-N質(zhì)量濃度由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L,NH3-N去除率達98.4%,表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
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(編輯 葉晶菁)
Screening of Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Strain from Refinery Wastewater
Wu Wenli,Yan Jiabao,Ji Nannan,Cao Xiaoshi,Hu Xixi,Wu You
(College of Chemical Engineering and Technology,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan Hubei 430081,China)
A heterotrophic nitrif i cation-aerobic denitrif i cation bacteria strain WY6 was isolated from activated sludge in the refinery wastewater treatment system. The WY6 was characterized and identified by physiological and biochemical experiments. The effects on nitrif i cation ability of the strain were studied,such as carbon source,m(C)∶m(N) of the medium,culture temperature,initial pH and inoculation amount. And its NH3-N removal ability was also investigated. The identif i cation results show that WY6 is a strain of Acinetobacter baumannii,and the suitable culture conditions for it are as follows:using sodium succinate as carbon source,culture temperature 30 ℃,initial pH 9.0,m(C)∶m(N)=10,inoculation amount 2.0%. When the ref i nery wastewater has treated under these conditions for 20 h,the NH3-N mass concentration can be decreased from 245.46 mg/L to 9.71 mg/L with 11.79 mg/(L·h) of average ammonia removal speed. After treated for 32 h by strain WY6,the NH3-N mass concentration of the actual ref i nery wastewater can be decreased from73.74 mg/L to 1.15 mg/L with 97.8% of NH3-N removing rate,which shows a good application prospect.
refinery wastewater;ammonia nitrogen;heterotrophic nitrification-aerobic denitrification;strain screening
X172
A
1006-1878(2015)04-0354-05
2015 - 03 - 18;
2015 - 04 - 29。
武文麗(1990—),女,甘肅省白銀市人,碩士生,電話 18971048322,電郵 121135637@qq.com。聯(lián)系人:顏家保,電話 18062689295,電郵 yanjb9198@126.com。
武漢科技大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點項目(JCX0006);武漢科技大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310488009)。