油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育與育性恢復(fù)機(jī)理的研究進(jìn)展

劉琪邇 杜坤 王幼平

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州　225009）

油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育與育性恢復(fù)機(jī)理的研究進(jìn)展

劉琪邇 杜坤 王幼平

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育不僅是研究核質(zhì)互作的理想材料，同時(shí)也是雜種優(yōu)勢(shì)利用的最有效方式之一。目前對(duì)油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究主要包括不育基因的來(lái)源、不育基因的結(jié)構(gòu)特征、不育基因的作用機(jī)理以及育性恢復(fù)的分子機(jī)制等。對(duì)目前國(guó)際上主要的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型（pol CMS、nap CMS、kos CMS、ogu CMS和tour CMS）在分子水平上的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。包括線粒體不育基因相關(guān)區(qū)域的確定和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不育形成的分子機(jī)理以及恢復(fù)基因的定位和作用機(jī)制等。

油菜；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；恢復(fù)基因

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑，與化學(xué)去雄、細(xì)胞核雄性不育、自交不親和等方式相比較，CMS是最為理想的授粉控制系統(tǒng)之一。目前國(guó)內(nèi)外已研究報(bào)道過(guò)的油菜CMS主要類型有：波里馬胞質(zhì)雄性不育系（pol CMS）、nap胞質(zhì)雄性不育系（nap CMS）、蘿卜胞質(zhì)雄性不育系（ogu CMS）、tour胞質(zhì)雄性不育系（tour CMS）、Kosena胞質(zhì)雄性不育系（kos CMS）、hau胞質(zhì)雄性不育系（hau CMS）等。植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育主要與線粒體基因組有關(guān)，植物的線粒體基因組不僅有其獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)，而且由于存在高度重組和外源DNA整合的特性，使線粒體基因組更為復(fù)雜。與CMS相關(guān)不育基因的研究主要是通過(guò)線粒體DNA（mt DNA）的限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）來(lái)研究線粒體不育基因的類型；也可以利用比較物理圖譜的方法來(lái)分析線粒體基因組結(jié)構(gòu)上的差異，從而進(jìn)一步確認(rèn)與不育相關(guān)的基因。本文對(duì)目前國(guó)際上主要的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的不育分子機(jī)理研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型以及不育相關(guān)基因區(qū)域

pol CMS：pol CMS是傅廷棟教授于1972年在甘藍(lán)型油菜品種“波里馬”中首次發(fā)現(xiàn)的天然細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型［1］。目前，在我國(guó)pol CMS被廣泛用于制備油菜雜交種［2］。早在1986年Erickson［3］就利用RFLP的方法比較了pol CMS和cam胞質(zhì)的mt DNA，限制性酶切片段表明兩者存在明顯的差異。Singh和Brown［4］通過(guò)對(duì)nap胞質(zhì)的甘藍(lán)型油菜保持系、pol CMS和恢復(fù)系中14個(gè)線粒體基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅在atp6基因區(qū)域處存在差異。atp6基因在pol CMS中有2.2 kb和1.9 kb的轉(zhuǎn)錄本，在nap CMS中僅轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1.1 kb的轉(zhuǎn)錄本，而在育性恢復(fù)后代中，該1.1 kb的轉(zhuǎn)錄本顯著上升，并且伴隨1.3 kb和1.4 kb兩個(gè)新轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生，后經(jīng)證實(shí)可能是恢復(fù)基因?qū)€粒體不育相關(guān)區(qū)域的調(diào)控作用［5］。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)在pol CMS的atp6基因上游由于線粒體基因組的重排產(chǎn)生了一個(gè)編碼224個(gè)氨基酸的嵌合式開(kāi)放閱讀框orf224，與atp6基因共轉(zhuǎn)錄形成pol CMS的不育相關(guān)基因［6］。L'Homme 和Brown［7］在比較甘藍(lán)型油菜cam胞質(zhì)可育系和pol CMS植株mt DNA物理圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者差異僅發(fā)生在atp6基因上游區(qū)域。在pol CMS中，該區(qū)域含有orf224并與atp6基因共轉(zhuǎn)錄，證實(shí)了orf224/atp6與pol CMS的相關(guān)性。Wang等［8］對(duì)甘藍(lán)型油菜pol CMS與花椰菜體細(xì)胞雜種后代中不育植株的mt DNA進(jìn)行分析，結(jié)果表明不育胞質(zhì)雜種都存在orf224/ atp6共轉(zhuǎn)錄本，與pol CMS不育性狀緊密連鎖，進(jìn)一步證實(shí)了orf224/atp6與pol CMS不育性狀是高度連鎖的。

nap CMS：Thompson［9］于1972年在波蘭春油菜品種Bronowski（父本）與冬油菜品種RD58（母本）雜交F2代中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)雄性不育植株，利用此雄性不育株與Bronowski回交選育出T CMS。而Shiga和Baba［10］從日本甘藍(lán)型油菜品種千莢油菜（母本）和北陸23（父本）的雜交后代中也發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)雄性不育植株，將這種不育胞質(zhì)稱為S CMS。進(jìn)一步研究證明T CMS和S CMS屬于同一類型，合稱nap CMS。1996年，L'Homme發(fā)現(xiàn)，pol CMS中的4.5 kb大小atp6/orf224轉(zhuǎn)錄本在cam胞質(zhì)中不存在，但卻位于nap CMS的 mt DNA上不同區(qū)域。該片段內(nèi)存在一個(gè)與orf224相似的orf222，與orf224有85%的序列相似性，有6個(gè)堿基的插入或缺失突變，其5'端也同樣來(lái)自orfB。通過(guò)預(yù)測(cè)得知orf222可以編碼產(chǎn)生一個(gè)26 kD的內(nèi)在膜蛋白，與orf224的預(yù)測(cè)產(chǎn)物有79%的同源性，具有極其相似的親水性結(jié)構(gòu)。且該片段位于nad5基因（編碼NADH脫氫酶復(fù)合體的一個(gè)亞基）第3個(gè)外顯子C端上游300 bp的位置，并與另一個(gè)功能未知閱讀框orf139共轉(zhuǎn)錄。利用特異引物對(duì)orf222進(jìn)行Northern Blot分析發(fā)現(xiàn)，只在nap CMS和nap胞質(zhì)恢復(fù)系中有2.0 kb和1.7kb大小的轉(zhuǎn)錄本，且nap CMS中orf222的轉(zhuǎn)錄本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)豐富于nap胞質(zhì)的恢復(fù)系。利用21個(gè)線粒體基因探針對(duì)nap CMS、nap恢復(fù)系和cam胞質(zhì)的保持系進(jìn)行Northern分析時(shí)發(fā)現(xiàn)只有orf222/nad5c/orf139區(qū)域轉(zhuǎn)錄本存在差異，證明了該區(qū)域與nap CMS有關(guān)［11］。

ogu CMS：是Ogura［12］首次在蘿卜中發(fā)現(xiàn)的天然雄性不育類型。1977年，Bannerot通過(guò)種間雜交和連續(xù)回交將甘藍(lán)型油菜的核導(dǎo)入蘿卜的ogu CMS中，得到了甘藍(lán)型油菜ogu CMS。其不育性狀十分穩(wěn)定，自然存在的油菜大多都是其保持系［13］。目前ogu CMS是北美及歐洲等地主要應(yīng)用于生產(chǎn)油菜雜交種的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。Bonhomme等［14］對(duì)ogu CMS的mt DNA進(jìn)行序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)一段包含orf138、orf158和一個(gè)tRNA基因（trnfM）的區(qū)域，該區(qū)域可能與雄性不育相關(guān)。orf138位于orf158（能夠編碼ATP合酶的8個(gè)亞基）的上游與之共轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一個(gè)1.4 kb的轉(zhuǎn)錄本。其中orf158在正常胞質(zhì)中也轉(zhuǎn)錄，而orf138只在ogu CMS中轉(zhuǎn)錄。在對(duì)orf138序列同源性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，包括orf138編碼區(qū)12個(gè)密碼子和3'側(cè)翼序列在內(nèi)的70個(gè)氨基酸與擬南芥中可能為NADH脫氫酶編碼的orf557的3'非翻譯區(qū)相同［15，16］。Duroc等［17］發(fā)現(xiàn)在ogu CMS中，orf138編碼一個(gè)膜結(jié)合蛋白，該蛋白與線粒體內(nèi)膜相連，分子量為22 kD，易形成寡聚體。將其在大腸桿菌中表達(dá)，能夠抑制大腸桿菌的正常生長(zhǎng)，說(shuō)明ORF138對(duì)細(xì)胞具有毒害作用。通過(guò)構(gòu)建orf138與綠色熒光蛋白GFP融合的靶向線粒體表達(dá)載體，將該基因的表達(dá)載體導(dǎo)入酵母和擬南芥中，來(lái)研究不育蛋白的結(jié)構(gòu)與雄性不育關(guān)系的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，ORF138蛋白并沒(méi)有抑制酵母的生長(zhǎng)，卻改變了酵母和植物細(xì)胞中的線粒體的外形，轉(zhuǎn)基因的擬南芥也沒(méi)有出現(xiàn)不育的性狀［18］。這可能與核表達(dá)的ORF138亞細(xì)胞定位有關(guān)。

kos CMS：Sakai等［19］利用另一種來(lái)源于蘿卜的胞質(zhì)不育類型kos CMS，通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)將該胞質(zhì)不育轉(zhuǎn)入B. napus［19，20］。在對(duì)蘿卜kos CMS線粒體DNA進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與CMS相關(guān)的基因orf125，該基因序列與ogu CMS不育基因orf138有較高的同源性，只存在2個(gè)氨基酸替換和39 bp處一個(gè)堿基缺失。在蘿卜kos CMS中orf 125與orfB共轉(zhuǎn)錄。然而在甘藍(lán)型油菜kos CMS中orf125的3'側(cè)翼區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)新的mt DNA序列。orf 125在兩種胞質(zhì)的CMS中都可以表達(dá)出蛋白，且育性恢復(fù)植株中ORF125含量顯著降低［21］。

tour CMS：tour CMS是 印 度 學(xué) 者Rawat和Anand［22］于1979年在芥菜型油菜中發(fā)現(xiàn)的天然細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料，Pradhan等證實(shí)該不育材料的細(xì)胞質(zhì)來(lái)源于非洲芥菜B. tournefortii，屬異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育［23，24］，目前這種不育胞質(zhì)在印度得到應(yīng)用。Landgren等［25］研究表明，tour CMS線粒體基因atp6存在兩個(gè)大小分別為2.3 kb和1.1 kb的轉(zhuǎn)錄本。其中2.3 kb的轉(zhuǎn)錄本中除了含有正常的atp6基因外，在其下游還含有一個(gè)異常的orf263。該2.3 kb的轉(zhuǎn)錄本與可育性狀共分離。在利用SDS-PAGE分析不育系、保持系和恢復(fù)系的線粒體總蛋白差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，存在有3個(gè)差異條帶分別是32 kD、29 kD和20.5 kD，其中20.5 kD與細(xì)胞質(zhì)的來(lái)源有關(guān)。32 kD的蛋白質(zhì)只存在于不育系中，而29 kD的蛋白在可育和育性恢復(fù)系中不存在或存在量很少［25］。

hau CMS：hau CMS是傅廷棟教授于1999年在芥菜型油菜中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。目前已經(jīng)利用回交的方法將該不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中去。Wan等［26］利用16個(gè)線粒體探針和酶切組合將hau CMS與其他4種CMS（pol CMS、nap CMS、ogu CMS、tour CMS）區(qū)分開(kāi)來(lái)，證明hau CMS是一種新型的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。借助hau CMS和保持系的多代回交的材料進(jìn)行線粒體基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，一個(gè)位于atp6基因下游，并與它共轉(zhuǎn)錄的新型開(kāi)放閱讀框orf288可能是hau CMS雄性不育相關(guān)的基因。利用Western blotting方法分析得出在雄性不育系中orf288能夠翻譯成蛋白質(zhì)。將orf288導(dǎo)入大腸桿菌中并表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ORF288明顯抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，暗示該蛋白對(duì)大腸桿菌有毒害作用，而且在有無(wú)線粒體靶向前導(dǎo)序列存在時(shí)orf288都能夠造成轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉敗育［27］。結(jié)果表明orf288是造成hau CMS的相關(guān)基因。orf288與tour CMS的不育基因orf263高度同源，可能是由于orf263中堿基置換和堿基缺失導(dǎo)致的閱讀框延長(zhǎng)所致［28］。

Nsa CMS：Nsa CMS是胡瓊（Hu）等［29］利用甘藍(lán)型油菜中雙4號(hào)與新疆野芥通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得的體細(xì)胞雜種，以后代中雄性不育株做母本，中雙4號(hào)做輪回親本回交多代創(chuàng)建的異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系［29-31］。在利用反向斑點(diǎn)雜交鑒定Nsa CMS相關(guān)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，nad2基因在Nsa CMS中的雜交信號(hào)弱于保持系，說(shuō)明在不育系中nad2基因表達(dá)受到抑制，推測(cè)nad2可能與Nsa CMS相關(guān)。

除此之外，目前報(bào)道的其他油菜CMS類型有：利用遠(yuǎn)源雜交從甘藍(lán)型油菜與埃塞俄比亞芥雜交后代中選育出的NCa CMS［30］；印度的Parkash和Bhat等［31］利用體細(xì)胞融合和有性雜交技術(shù)獲得的芥菜型油菜Mor CMS。李殿榮等［32］從復(fù)式雜交后代中選育的Shan 2A；還有本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)甘藍(lán)型油菜與白芥電融合，從雜種后代中選育出的細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料SaNa-1A等［33］。

綜上所述，線粒體雄性不育基因通常具有下列特點(diǎn)：常與atp6、atp8或atp9等功能基因嵌合并共轉(zhuǎn)錄，油菜CMS主要屬于這種類型。此外，大部分的不育基因中都含有與已知的線粒體功能基因相似的片段（頻繁重組所致），部分不育基因含有跨膜結(jié)構(gòu)。如ogu CMS中的orf138是線粒體基因組小的同源區(qū)域之間重新組合形成的。

2 不育基因的作用機(jī)理

pol CMS中的orf224造成不育的原因有兩種假說(shuō)：一是認(rèn)為orf224與atp6基因共轉(zhuǎn)錄，減少了正常atp6基因轉(zhuǎn)錄從而降低ATP合酶亞基的蛋白量，造成線粒體能量供應(yīng)異常，從而引起花粉敗育。二是認(rèn)為orf224可能產(chǎn)生出一種毒蛋白，引起不育。趙敏榮等［34］將擴(kuò)增出的orf224基因片段在大腸桿菌中表達(dá)，并未檢測(cè)出ORF224蛋白，但發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后的重組菌株的生長(zhǎng)受到抑制，利用特異性抗體可以檢測(cè)到orf224基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有抑制或毒害作用。最近，通過(guò)對(duì)pol CMS近等基因系可育和不育花蕾轉(zhuǎn)錄組差異的比較，結(jié)果表明有1 148個(gè)unigene表達(dá)水平明顯改變，這些基因主要是代謝和蛋白合成通路相關(guān)基因，一些控制花粉囊發(fā)育的unigene在不育系中明顯下調(diào)。推測(cè)orf224/ atp6造成的能量缺乏可能是由于一些線粒體基因與核基因的相互作用抑制了一些調(diào)控花粉發(fā)育的基因的表達(dá)；由于缺乏ATP合酶亞基蛋白，造成的能量缺乏，會(huì)導(dǎo)致pol CMS雄性不育系中造孢細(xì)胞不能正常分化，最終造成花粉敗育［35］。與pol CMS不育形成機(jī)理相似，nap CMS也可能是orf222與鄰近的atp6基因共轉(zhuǎn)錄，造成atp6基因單順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本減少，從而減少了atp6基因編碼的蛋白量，致使nap CMS線粒體的功能異常，能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致不育。Dong等［36］利用基因芯片對(duì)白菜型油菜ogu CMS和保持系花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)錄模式分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不育系中特異表達(dá)基因包括脅迫相關(guān)和氧化還原相關(guān)的基因，一些與花粉外壁形成以及花粉萌發(fā)相關(guān)基因在不育系中表達(dá)被抑制，而與生長(zhǎng)素、ATP合成、花粉發(fā)育和應(yīng)激相關(guān)的核基因表達(dá)發(fā)生延遲。對(duì)Nsa CMS與其恢復(fù)系NR1雜交產(chǎn)生的可育和不育后代的幼嫩花蕾轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在可育后代中檢測(cè)到更多的特異表達(dá)基因，主要是一些花粉壁裝配相關(guān)基因；在不育后代中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)與檸檬酸循環(huán)有關(guān)基因、ATP合酶相關(guān)基因、氧化還原酶相關(guān)基因顯著下調(diào)，除此之外許多有關(guān)戊糖磷酸途徑、糖代謝途徑、碳固定基因表達(dá)模式也發(fā)生了改變［37］。

目前關(guān)于線粒體基因調(diào)控核基因表達(dá)的了解還不多，而細(xì)胞質(zhì)雄性不育是研究核質(zhì)互作的重要材料。Yang等［38］利用芥菜型油菜不育系來(lái)研究逆行調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)在不育系和保持系中差異表達(dá)的線粒體基因BjRCE1能夠逆行調(diào)控生長(zhǎng)素應(yīng)答的相關(guān)基因的表達(dá)，造成生長(zhǎng)素應(yīng)答通路的改變。為了研究miRNA的作用與芥菜型油菜不育系花粉敗育和花器官的畸形發(fā)育之間關(guān)系，Yang等［39］建立了芥菜型油菜不育系中由miRNA介導(dǎo)的核質(zhì)互作模型。發(fā)現(xiàn)47個(gè)miRNA在不育和保持系中差異表達(dá)，降解組分析顯示miRNA靶基因包括生長(zhǎng)素應(yīng)答因子，NAC轉(zhuǎn)錄因子，GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子，MYB轉(zhuǎn)錄因子等在基因調(diào)控中扮演了重要角色。目前也有研究者利用甲基化敏感多態(tài)性擴(kuò)增（Methylation sensitive amplymorphism，MSAP）研究不育和可育胞質(zhì)與DNA甲基化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，核基因的甲基化明顯受到雄性不育胞質(zhì)的影響［40］。

在植物線粒體基因組中與CMS相關(guān)的ORF是如何導(dǎo)致線粒體功能喪失的機(jī)制還不清楚。有可能是新的ORF導(dǎo)致線粒體能量供給不足，也有可能是CMS蛋白毒性會(huì)導(dǎo)致花粉敗育，但均沒(méi)有直接證據(jù)，相關(guān)的研究有待進(jìn)一步深入。

3 油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因及作用機(jī)理

油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的定位是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)于恢復(fù)基因的研究主要利用分子標(biāo)記技術(shù)和連鎖圖譜，包括RFLP、RAPD、AFLP和SSR進(jìn)行定位，恢復(fù)基因的作用機(jī)制主要從影響CMS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、影響CMS相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的加工編輯以及影響轉(zhuǎn)錄本的翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

pol CMS的恢復(fù)基因主要存在于歐洲甘藍(lán)型油菜品種中，位于A基因組染色體上［41］。遺傳分析證明pol CMS的育性恢復(fù)基因（Rfp）是顯性單基因［42，43］。也有人認(rèn)為pol CMS恢復(fù)基因由2對(duì)主效基因Rfp1和Rfp2控制，均被定位在第18條染色體上［44］。Yuan等［45］利用10個(gè)線粒體基因探針對(duì)pol CMS、恢復(fù)系和保持系的花蕾線粒體進(jìn)行Northern檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)系中由于Rfp基因的存在可能使得不育系中2.2 kb和1.9 kb轉(zhuǎn)錄本發(fā)生降解產(chǎn)生2個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，即orf224/atp6轉(zhuǎn)錄可由核恢復(fù)基因來(lái)調(diào)控。Li等［46］發(fā)現(xiàn)nap CMS的核恢復(fù)基因（Rfn）與Rfp基因是等位基因，兩者都能通過(guò)除去轉(zhuǎn)錄本5'端序列來(lái)影響不育基因的表達(dá)［5，47］。

核恢復(fù)基因的研究主要集中在篩選和創(chuàng)建與Rfp位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記［48］。Liu等［49］在Zhao［50］創(chuàng)建的2個(gè)SCAR 標(biāo)記和B. napus與蕓薹屬其他種的同線性區(qū)域基礎(chǔ)上，將Rfp基因定位到B. rapa基因組29.2 kb區(qū)域上。在此區(qū)域內(nèi)包含7個(gè)開(kāi)放式閱讀框，其中ORF2編碼一個(gè)PPR蛋白，成為Rfp最有可能的候選基因［49］。PPR蛋白是一種RNA結(jié)合蛋白，由35個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)組成，目前已知該蛋白在線粒體和葉綠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后編輯修飾的過(guò)程中起重要作用［51，52］。這種PPR蛋白可能在轉(zhuǎn)錄后水平影響不育相關(guān)區(qū)域轉(zhuǎn)錄本的加工編輯，編輯過(guò)的RNA能夠翻譯出正常的蛋白質(zhì)，從而引起育性恢復(fù)。Krishnasamy等和Bellaoui等［53，54］在對(duì)ogu CMS的育性恢復(fù)系中ORF138蛋白表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)由于核恢復(fù)基因（Rfo）的存在使得ORF138蛋白的積累明顯減少但是對(duì)orf138轉(zhuǎn)錄本的大小、豐度或RNA的編輯模式?jīng)]有影響。Brown等和Desloire等［55，56］通過(guò)對(duì)擬南芥和蘿卜的微共線性分析，結(jié)合圖位克隆方法克隆Rfo基因，將Rfo定位到蘿卜染色體22 kb左右的區(qū)域，該區(qū)域包含3個(gè)PPR蛋白基因（PPR-A、PPR-B、PPR-C）。Uyttewaal等［57］證實(shí)了PPR-B在恢復(fù)育性時(shí)的主要作用就是抑制ORF138蛋白在絨氈層內(nèi)的化學(xué)合成。但PPR-B蛋白不能影響orf138基因的mRNA的積累。最終離體免疫沉淀反應(yīng)證實(shí)了PPR-B能夠直接或間接的與orf138的RNA相互作用，這些證據(jù)都支持PPR-B在orf138轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起關(guān)鍵作用。Qin等［58］通過(guò)比較rfo/rfo和Rfo/Rfo純合子植株的轉(zhuǎn)錄本序列時(shí)發(fā)現(xiàn)Rfo的等位基因PPR-A帶有4個(gè)相同氨基酸的缺失，在Rfo蛋白的中心區(qū)域的這4個(gè)氨基酸刪除，發(fā)現(xiàn)其育性恢復(fù)能力降低，揭示了ogu CMS中的Rfo一級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能之間的關(guān)系。在ogu CMS油菜中也常發(fā)現(xiàn)育性自然恢復(fù)現(xiàn)象，ogu CMS的育性恢復(fù)突變株可能是含有orf138基因的優(yōu)勢(shì)片段超過(guò)臨界值的結(jié)果［16］。ogu CMS的不育性十分穩(wěn)定，但是其育性恢復(fù)基因僅存在于蘿卜基因組中，難以直接利用，所以轉(zhuǎn)育蘿卜恢復(fù)基因是實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜ogu CMS應(yīng)用的關(guān)鍵。法國(guó)等一些歐洲國(guó)家已經(jīng)實(shí)現(xiàn)ogu CMS的三系配套并擁有各自的品種專利權(quán)，而我國(guó)還沒(méi)有對(duì)ogu CMS進(jìn)行大規(guī)模的利用，陳衛(wèi)江等［59］創(chuàng)制了甘藍(lán)型油菜ogu CMS恢復(fù)材料CLR650。前期研究結(jié)果表明，在油菜pol CMS、nap CMS、ogu CMS中的恢復(fù)基因Rfp、Rfn、Rfo不會(huì)阻止不育基因的轉(zhuǎn)錄，反而影響轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上的調(diào)控，使得不育基因的表達(dá)受到抑制，從而恢復(fù)其育性。

來(lái)自不同胞質(zhì)的核恢復(fù)基因可以具有共同生物學(xué)功能。例如，在芥菜型油菜4種CMS系中具有相同的不育基因（orf108），并且分享共同的恢復(fù)基因。研究發(fā)現(xiàn)，含有orf108/atpA的雙順?lè)醋有蛄袑rf108轉(zhuǎn)入擬南芥中會(huì)出現(xiàn)50%的不育花粉，這暗示著orf108在配子體階段具有致死性。orf108廣泛分布在蕓薹屬植物的各種野生近緣物種中，這也首次展示了不同來(lái)源和不同形態(tài)CMS可以具有相同的分子基礎(chǔ)［60］。

Koizuka等［61］研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)顯性等位基因Rf1和Rf2共同控制kos CMS的育性恢復(fù)。恢復(fù)基因Rf1在翻譯水平或翻譯后水平調(diào)控ORF125蛋白的積累，并與Rf2相互作用從而使育性得到恢復(fù)。為了鑒定Rf基因，日本學(xué)者將含有關(guān)鍵基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜觀察育性恢復(fù)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)4.7 kb大小的Bam H I/Hpa I酶切片段能夠恢復(fù)kos CMS育性。該片段中包含一個(gè)編碼687個(gè)氨基酸的orf687和16個(gè)重復(fù)的PPR基序。在不育系中orf687的等位基因的第3和第4個(gè)重復(fù)PPR序列中有4個(gè)氨基酸的替換，并推測(cè)ORF687可能直接或間接的降低ORF125蛋白水平，從而使不育植株恢復(fù)育性［62］。此外，Janeja［63］在尋找tour CMS的恢復(fù)基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)核恢復(fù)基因，一個(gè)主效基因（Rft1）和次效基因（Rft2）共同恢復(fù)不育系的育性。Rft1基因可以完全恢復(fù)育性，而Rf2只能部分恢復(fù)育性；并且篩選了5種AFLP分子標(biāo)記，其中EACC/MCTT105，EAAG/MCTC80是Rft1的翼側(cè)標(biāo)記。

4 結(jié)語(yǔ)

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育具有極高利用價(jià)值的生物學(xué)特征，它的形成機(jī)制復(fù)雜，涉及到核質(zhì)互作、基因表達(dá)調(diào)控和環(huán)境等各種因素的影響。目前關(guān)于其不育機(jī)理的研究主要集中在mt DNA上的一些異常開(kāi)放式閱讀框，但是這些基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)究竟有哪些功能，如何引起雄性不育的還不清楚。對(duì)于油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的研究首先是確定不育基因，克隆不育基因?qū)⑵湓谠松镏斜磉_(dá)，分析表達(dá)蛋白的功能特性，其次構(gòu)建線粒體定位的器官特異表達(dá)載體，鑒定轉(zhuǎn)基因植株的育性情況。而對(duì)育性恢復(fù)基因進(jìn)行分析時(shí)應(yīng)先將其在物理圖譜上定位，再精細(xì)定位、克隆恢復(fù)基因，再研究恢復(fù)基因?qū)Σ挥虻恼{(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on M echanism s of Cytop lasm ic M ale Sterility and Fertility Restoration in Rapeseed

Liu Qi’er Du Kun Wang Youping
（College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou225009）

Cytoplasmic male sterility（CMS）is an ideal material to study nuclear-cytoplasm interactions， meanwhile it is one of the most effective ways to use heterosis. The researches related to rapeseed CMS in recent years focused on the analysis of structure characteristics and origins of the sterility genes， the mechanism of sterility gene and the restoration of fertility. This paper introduced the current international main types of CMS（pol CMS， nap CMS， kos CMS， ogu CMS and tour CMS）in rapeseed， and also reviewed the research progress of molecular level，including the identification of CMS-associated regions， the possible mechanism of CMS and the localization of restorer genes.

rapeseed；cytoplasmic male sterility（CMS）；restorer gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.004

2015-01-24

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20123250110009），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571699）

劉琪邇，女，碩士研究生，研究方向：油菜遺傳育種；E-mail：376962496@qq.com

王幼平，男，教授，研究方向：油菜遺傳育種；E-mail：wangyp@yzu.edu.cn