乙型肝炎病毒感染對輔助生殖技術(shù)的影響與探究

柳榴，文妍琪，趙萌，楊菁

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一。HBV 屬于嗜肝脫氧核糖核酸病毒科［1］，能引起急慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌等嚴(yán)重疾病。慢性HBV 感染是指血清乙肝表面抗原（HBsAg）陽性持續(xù)6個月以上。HBV 的感染呈世界性分布，不同地區(qū)的HBV 流行率差異較大，我國屬于高發(fā)性流行地區(qū)，其慢性感染人數(shù)約占全球HBV 慢性感染人數(shù)的1／3［2］。HBV 傳播途徑主要有水平傳播和垂直傳播。水平傳播是指HBV 在外環(huán)境中借助傳播因素而相互傳播，主要有血液（或血制品）等體液經(jīng)破損的皮膚及黏膜傳播、性傳播和醫(yī)源性傳播。垂直性傳播是指HBV 病毒經(jīng)由親代傳給子代，包括父-嬰傳播和母-嬰傳播。

近年來，越來越多的不孕患者選擇輔助生殖技術(shù)（ART）行助孕治療，而對進(jìn)行試管嬰兒輔助技術(shù)治療的不孕夫婦的血清病毒篩查時發(fā)現(xiàn)，HBV 慢性感染人數(shù)占有相當(dāng)大的數(shù)量。從倫理學(xué)的角度來看，試管嬰兒妊娠過程與自然妊娠過程相同，所以沒有理由去拒絕HBsAg陽性的夫婦接受試管嬰兒治療，僅對于供卵者或供精者來說，需接受血清HBV的篩查，且最長有效期在6個月之內(nèi)。因此，正確認(rèn)識HBV 在ART 中可能產(chǎn)生的影響，對疾病有效的預(yù)防、ART 結(jié)局的預(yù)測和實驗室的管理有著非常重要的意義。本文就近年來這方面的研究進(jìn)展做一綜述。

一、男性HBV 慢性感染在ART 過程中可能產(chǎn)生的影響

1.對精子質(zhì)量和相關(guān)功能的影響：HBV 是一種噬肝性病毒，它不僅存在于肝臟，也存在于肝外組織如：生殖性腺、腎臟、腮腺等組織。1985 年Hadchouel等［3］首次在乙肝患者的精液中監(jiān)測到有游離型和整合型HBV DNA 的存在。隨后，有研究表明經(jīng)HBV DNA 感染的精子與HBV 陰性配偶的卵母細(xì)胞結(jié)合后，能在受精卵內(nèi)復(fù)制，最終進(jìn)入胎兒組織［4-6］。其機(jī)制可能與HBV 能穿過血睪屏障，并且其DNA 整合入精子的染色體，與卵母細(xì)胞結(jié)合后隨染色體進(jìn)入受精卵，最終進(jìn)入胚胎有關(guān)。

HBV 能夠感染精子，進(jìn)而對精子的質(zhì)量和功能也產(chǎn)生影響。有研究表明HBV 感染的男性患者精液分析結(jié)果出現(xiàn)低密度［7-9］、低活力［7，9-10］、低正常形態(tài) 率［7，10-12］，且HBV 感 染 能 增 加 少、弱 精 子 癥 和 無精子癥的比例［7］。以上研究均能說明HBV 能引起精液及精子的病變。鄭九嘉等［10］對273 例男性HBsAg陽性和254 例男性HBsAg 陰性患者同時進(jìn)行精子DNA 碎片指數(shù)（DFI）、頂體酶活性和精子核蛋白組轉(zhuǎn)換分析，發(fā)現(xiàn)HBsAg 陽性組精子DFI高，頂體酶活性較低。因此，得出了HBV 感染對精子DFI和頂體酶活性等功能指標(biāo)造成損傷這一結(jié)論。另外，一些研究也顯示HBV 感染的男性患者在ART 中 表 現(xiàn) 出 低 受 精 率［7，9，11］。究 其 原 因 可 能如下：（1）HBV DNA 整合入精子染色體后，能夠影響精子遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，增加精子染色體畸變率，最終導(dǎo)致男性生殖細(xì)胞的遺傳缺陷及影響精子形成［13-14］。（2）HBV 感染能夠增加精子的壞死和凋亡，并導(dǎo)致精子膜完整性及精子線粒體膜電位的消失，最終影響精子的功能［15］。（3）HBV 在局部組織易形成抗原-抗體沉淀物，從而引起機(jī)體局部組織的炎癥和免疫應(yīng)答，最終對精子功能造成損傷［7］。

2.對妊娠結(jié)局的影響：目前不同學(xué)者關(guān)于男性HBV 感染對妊娠結(jié)局的影響的研究結(jié)果存在爭議。Zhou等［7］和Pirwany等［16］發(fā) 現(xiàn)HBV 感 染 的 男 性患者表現(xiàn)出低著床率和臨床妊娠率。而受損的精子質(zhì)量可能是低著床率和臨床妊娠率的原因之一。但是Lee等［12］和Bu等［17］發(fā)現(xiàn)男性患者的體外受精和胚胎移植（IVF-ET）治療結(jié)局不受HBV 慢性感染的影響。甚至Lam 等［18］發(fā)現(xiàn)夫妻雙方至少一方感染HBV 可以獲得更好的IVF-ET 結(jié)局，有著更高的著床率和妊娠率，但是其具體機(jī)制仍不明確。這些差異性可能與受試者地域或人群種族的差異、實驗中實驗對照組配對標(biāo)準(zhǔn)的差異、以及ART 中出現(xiàn)的多種因素有關(guān)。因此，對于男性HBV 感染是否對ART 造成影響，仍需更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇髽颖狙芯縼磉M(jìn)一步證實。

對于男性HBsAg 陽性的不孕夫婦來說，進(jìn)行ART 治療前，女性應(yīng)該注射疫苗來避免圍產(chǎn)期對胎兒的傳播，若抗乙肝表面抗原抗體（HBsAb）滴度達(dá)到10U／L，試管嬰兒治療就可以進(jìn)行［19］。

二、女性HBV 慢性感染在ART 過程中可能產(chǎn)生的影響

1.對卵母細(xì)胞質(zhì)量和卵巢儲備功能的影響：有研究［4］顯示，在女性慢性HBV 感染者的卵巢間質(zhì)、卵巢間質(zhì)細(xì)胞、卵母細(xì)胞、以及血管內(nèi)皮細(xì)胞中能夠檢測出HBsAg 的存在。隨后又有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HBV DNA 序列能夠穿過卵母細(xì)胞的透明帶和細(xì)胞膜并整合于卵母細(xì)胞的基因組，然后在卵細(xì)胞的不同階段進(jìn)行復(fù)制［20-21］。Nie等［22］對女性HBsAg陽性而其配偶陰性進(jìn)行HBV DNA 和RNA 的分析，發(fā)現(xiàn)HBsAg存在于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和胚胎。以上均提示了HBV 能通過女性生殖細(xì)胞垂直傳播的可能性。即HBV DNA 在基因組內(nèi)存在單位點或多位點整合，HBV DNA 能夠以這種方式整合入卵母細(xì)胞基因組內(nèi)，并通過受精的方式傳遞給早期胚胎［23］。但這種垂直傳播的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

HBV 能夠感染卵母細(xì)胞，那么對卵巢儲備功能和卵母細(xì)胞的質(zhì)量能否造成影響呢？上面提到HBV 是可能影響精子遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性以及通過抗原抗體復(fù)合物沉積在組織中觸發(fā)炎癥損傷組織，在此處這種可能性仍然適用。2013年李苗［24］通過觀察HBV 感染與顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，HBV感染可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。2014年Shi等［11］通過對年齡、不孕的原因以及采卵日期進(jìn)行嚴(yán)格配對后，發(fā)現(xiàn)HBV 感染的女性有低優(yōu)胚率、低受精率，并指出這可能與HBV 感染損傷卵細(xì)胞功能有關(guān)。卵巢儲備功能指標(biāo)包括基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH），基礎(chǔ)雌激素如雌二醇（E2），基礎(chǔ)FSH／黃體生成激素（LH）比值，卵巢體積、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)（AFC）及卵巢基質(zhì)收縮期血流等［25］。遺憾的是，目前尚未見到專門描述HBV 感染與女性卵巢儲備功能相關(guān)指標(biāo)之間關(guān)系的權(quán)威報道，在這方面應(yīng)值得予以更多的關(guān)注與研究。

2.對妊娠結(jié)局的影響：聶睿［26］對3 457對不孕夫婦進(jìn)行HBV 感染的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不孕夫婦中HBV總感染率高于一般人群感染率，提示HBV 感染可能影響感染者的生育能力。但是目前關(guān)于HBV 不孕婦女IVF 結(jié)局的報道不多且結(jié)論并不一致。大多數(shù)研究報道女性HBV 感染對IVF妊娠結(jié)局臨床妊 娠率并 無 影 響［27-28］。但 是，Lam 等［18］對34 例 女性HBV 感染組和156 例女性HBV 陰性對照組、102例按1∶3配對的女性HBV 陰性對照組進(jìn)行了研究，得出了HBV 感染組相比于對照組有高植入率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率，但其機(jī)制不明。胚胎移植往往是在所獲得的受精卵中選取最優(yōu)的2或3個受精卵來進(jìn)行移植，以上的這些結(jié)論還可能與優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇有關(guān)。但是對于女性HBV 感染是否會影響妊娠結(jié)局，這就仍然需要更多更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯繄蟮纴碜C實。

HBsAg陽性患者HBV 的母嬰垂直傳播與HBV DNA 水平或者乙肝e抗原（HBeAg）陽性有關(guān)［29］。通常認(rèn)為，當(dāng)血清HBV DNA≥106拷貝／ml或者HBeAg陽性時，表明病毒量高，易發(fā)生母嬰傳播［30］。因此，對于每一個來進(jìn)行ART 治療的HBsAg陽性女性不孕患者，應(yīng)該進(jìn)一步行HBV DNA的檢測，若同時有HBV DNA 陽性，應(yīng)該推薦其去感染科進(jìn)行治療，同時進(jìn)行HBV DNA 監(jiān)測，最好在病毒指數(shù)低的情況下進(jìn)行輔助受精，同時應(yīng)告知夫妻雙方HBV 在妊娠和分娩過程中的傳播可能性。

三、HBV 與胚胎實驗室壞境

1.胚胎實驗室環(huán)境的特殊性：HBV 在感染患者的血液中高濃度存在，且在精液或者卵泡液中的含量與血液中的量呈正相關(guān)。胚胎實驗室工作者平時直接或者間接接觸大量的血液、卵泡液、精液，處理標(biāo)本時所用的試管、儀器以及操作時可能造成的液體飛濺，都會是實驗室內(nèi)環(huán)境病原體污染的來源。值得提出的是，實驗室的溫度和濕度以及培養(yǎng)體液所用的培養(yǎng)基都有利于HBV 的存活。

一般來說，HBV 感染是最常見的實驗室獲得性感染，實驗室工作者感染HBV 的危險率是普通公眾環(huán)境下的10倍，是其他醫(yī)療環(huán)境下的3倍。胚胎實驗室工作者完全可能會通過皮膚、黏膜接觸或口腔吞咽而感染。而受感染后的實驗人員也會成為傳染源，在胚胎操作過程中將病毒傳染給胚胎。為了減少胚胎實驗室的病毒傳播，一個綜合的安全的措施應(yīng)該被制定和實施，并且需要每個實驗工作者嚴(yán)格的遵守。建議實驗工作者操作時，需把每份體液或者胚胎樣品都當(dāng)做已被病毒污染的一樣小心對待；實驗室內(nèi)注意佩戴手套、隔離衣、口罩、眼罩（若必要時）；離心時需蓋緊試管蓋子；定期清洗實驗儀器；配置專門的洗手池和洗眼池；脫衣和摘手套后立即洗手，尤其是當(dāng)其污染后；禁止在實驗室里吃喝、吸煙、化妝；禁止在儲存標(biāo)本或?qū)嶒炘噭┑谋淅锎娣攀澄铮蛔詈笸扑]所有健康的實驗工作者都應(yīng)該注射HBV 疫苗［31］。

2.精、卵以及胚胎能夠感染外源性的HBV DNA：正常的活精子具有結(jié)合外源HBV DNA 的能力，并能在與卵母細(xì)胞受精時轉(zhuǎn)入卵細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而傳遞給子代［32］。在胚胎實驗室往往需要對精液進(jìn)行洗滌并去除精漿，而有研究報道去除精漿后的精液更容易捕獲外源HBV［33］。同樣也有實驗動物研究，對小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外研究顯示：卵母細(xì)胞能夠被動地攝取外源性HBV［34］。胚胎作為一個移植物，外界環(huán)境中HBV 能夠感染胚胎并在胚胎內(nèi)得到穩(wěn)定的表達(dá)。因此，如何防止HBV 在實驗室中的傳播成為每個胚胎實驗室工作者關(guān)注的焦點。周樺等［35］給出了如下幾點建議：（1）洗滌HBV 病毒感染的配子和胚胎，對于減少病毒拷貝數(shù)能起一定的作用；（2）對HBV 感染的不孕患者進(jìn)行取卵手術(shù)或者胚胎移植手術(shù)時，應(yīng)該盡量按照HBV 感染者—HBV DNA 陰性的HBV 感染者—HBV DNA 陽性的HBV 感染者的順序來進(jìn)行；（3）封閉式玻璃化冷凍法代替開放式冷凍法，避免交叉污染；（4）亞甲藍(lán)光化學(xué)法對HBV 感染者的精液或卵泡液滅活病毒也是一個較好的選擇；（5）建議對HBV 感染者有單獨的配子及胚胎處理室，并使用固定的培養(yǎng)箱和保存用的液氮罐，以避免交叉污染。

總之，隨著越來越多的不孕患者選擇ART 方式來進(jìn)行助孕治療，在這個治療過程中往往會出現(xiàn)許多高風(fēng)險的情況需要進(jìn)行調(diào)控，HBV 感染是其中之一。雖然已指出HBV 感染在夫妻雙方生殖細(xì)胞的垂直傳播及能對生殖細(xì)胞造成損傷，但是對妊娠結(jié)局的影響及其具體產(chǎn)生的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。HBV 不僅對雙親和子代帶來影響，對實驗工作者和醫(yī)護(hù)人員同樣帶來風(fēng)險。因此，重視HBV感染可能在ART 中帶來的影響，對該疾病有效地預(yù)防、ART 結(jié)局的預(yù)測和實驗室的管理有著非常重要的意義。

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