不同濃度阿司匹林對成骨細(xì)胞增殖的影響

王昌超，成業(yè)東，黃亞東，高超，姜鵬，馮海波，王加波，黃妍

(1中國人民解放軍第82醫(yī)院，江蘇淮安223001;2江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

骨質(zhì)疏松癥是中老年人的常見疾病之一，嚴(yán)重影響中老年人，特別是老年女性的健康和生活質(zhì)量。目前，抗骨質(zhì)疏松藥物種類較多，但在應(yīng)用過程中多存在不良反應(yīng)大、療程長、療效不佳等問題，患者治療依從性較差。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度阿司匹林服用一年以上能提高老年人的骨密度［1］，說明阿司匹林具有潛在的抗骨質(zhì)疏松作用，但目前相關(guān)研究報道較少。2011～2014年，我們觀察了不同濃度阿司匹林對成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在為阿司匹林治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細(xì)胞株(hFOBI.19)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。主要試劑:阿司匹林(美國Sigma公司)，置于無菌注射用水溶解，加入NaOH滴定至pH 7.0，配制成濃度為100 mmol/L阿司匹林溶液;DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Gibco公司;FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司;CCK-8試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 成骨細(xì)胞體外培養(yǎng) 成骨細(xì)胞復(fù)蘇后接種于底面積為75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 mL DMEM/F12培養(yǎng)基和1 mL FBS，置于34℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞貼壁生長，每2～3天換液一次，第8～10天細(xì)胞長滿瓶底后傳代，取傳3～6代的成骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 成骨細(xì)胞增殖活性檢測 采用CCK-8法。調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。飽和濕度下，34℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼滿瓶底后，隨機(jī)分為阿司匹林低、中、高濃度組及對照組。阿司匹林低、中、高濃度組分別加入含終濃度為0.5、2、10 mmol/L阿司匹林的培養(yǎng)液［2］200 μL，對照組只加入培養(yǎng)液(含 10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基)200 μL，同時設(shè)空白對照組。每組設(shè)8個復(fù)孔。干預(yù)24 h，PBS洗滌3次，每孔按1∶9比例加入CCK-8溶液及培養(yǎng)液共100 μL，培養(yǎng)4 h，分光光度計檢測450 nm波長處吸光度值(OD值)，即代表成骨細(xì)胞的增殖活性。

1.4 成骨細(xì)胞凋亡檢測 調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)至細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底，隨機(jī)分為阿司匹林低、中、高濃度組及對照組。阿司匹林低、中、高濃度組分別加入終濃度為 0.5、2、10 mmol/L 阿司匹林的培養(yǎng)液 2 mL，對照組不予處理。培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，加入400 μL Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL室溫避光孵育15 min，600 r/min離心沉淀5 min，將沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗滌1次，加入10 μL PI染色液，冰浴避光放置10 min，流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，結(jié)果比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組成骨細(xì)胞增殖活性比較 阿司匹林低、中、高濃度組 OD 值分別為 0.740 ±0.040、0.780 ±0.034、0.480 ±0.058，對照組為 0.620 ±0.031。阿司匹林低、中濃度組成骨細(xì)胞增殖活性明顯高于對照組、阿司匹林高濃度組(P均＜0.05)，阿司匹林高濃度組明顯低于對照組(P＜0.05)，而阿司匹林低、中濃度組差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 各組成骨細(xì)胞凋亡率比較 對照組成骨細(xì)胞凋亡率為10.35% ±0.39%，阿司匹林低、中、高濃度組分別為 8.30% ±0.35%、9.96% ±0.34%、11.3% ±0.35%。阿司匹林低、高濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)，阿司匹林中濃度組與對照組差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

成骨細(xì)胞是骨形成過程中的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。成骨的關(guān)鍵是成骨細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)。成骨細(xì)胞數(shù)量增加及功能增強(qiáng)均能發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。因此，抗成骨細(xì)胞凋亡或改進(jìn)成骨細(xì)胞功能成為治療骨質(zhì)疏松癥的有效方法［3］。

Yamaza等［4］研究證實(shí)，低濃度阿司匹林能改善去勢小鼠骨小梁和皮質(zhì)骨密度;Wei等［5］進(jìn)行的動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，阿司匹林具有促進(jìn)成骨作用［5］。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，長期口服阿司匹林能提高老年患者的骨密度［1］。但阿司匹林抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制尚未完全闡明［6］。有研究認(rèn)為，阿司匹林可通過刺激骨形成途徑促進(jìn)骨小梁的改建，改善骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，增加骨密度及力學(xué)強(qiáng)度［7］;通過COX-2酶、PGE2等參與成骨細(xì)胞合成［8］，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、成熟、礦化［9，10］。目前公認(rèn)的抗骨質(zhì)疏松經(jīng)典通路為RANK-RANKL骨保護(hù)素和Wnt通路。阿司匹林影響Runx2表達(dá)，而Runx2刺激BMP2形成，通過 RANK-RANKL通路起抗骨質(zhì)疏松作用［11，12］。阿司匹林可阻止 RANKL 誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，加速退化磷酸蛋白的降解，增加Wnt信號的水平，從而通過Wnt通路起抗骨質(zhì)疏松作用［3］。Urganus等［13］認(rèn)為，長期服用阿司匹林去勢小鼠RANKL減少和OPG增加。因此推測，阿司匹林可用于骨質(zhì)疏松的治療。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林低、中濃度組可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，阿司匹林低濃度組還能抑制成骨細(xì)胞凋亡，而阿司匹林中濃度組對成骨細(xì)胞凋亡無明顯影響;阿司匹林高濃度組可抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，低濃度阿司匹林能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡，對骨質(zhì)疏松治療有效。

綜上所述，低濃度阿司匹林能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，有可能用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療。此外，阿司匹林作為中老年人的常用藥，不良反應(yīng)少、價格便宜，有更廣泛的應(yīng)用前景。

［1］Carbone LD，Tylavsky FA，Cauley JA，et al.Association between bone mineral density and the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and aspirin:impact of cyclooxygenase selectivity［J］.J Bone Miner Res，2003，18(10):1795-1802.

［2］牛二龍，張毅，李陽，等.小劑量阿司匹林對去勢大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響［J］.中國矯形外科雜志，2013，21(12):1228-1234.

［3］ Krishnan V，Bryant HU，Macdougald OA.Regulation of bone mass by Wnt signaling［J］.J Clin Invest，2006，116(5):1202-1209.

［4］Yamaza T，Miura Y，Bi Y，et al.Pharmacologic stem cell based intervention as a new approach to osteoporosis treatment in rodents［J］.PLoS One，2008，3(7):e2615.

［5］Wei J，Wang J，Gong Y，et al.Effectiveness of combined salmon calcitonin and aspirin therapy for osteoporosis in ovariectomized rats［J］.Mol Med Rep，2015，12(2):1717-1726.

［6］Garcia-Martinez O，De Luna-Bertos E，Ramos-Torrecillas J，et al.Repercussions of NSAIDS drugs on bone tissue:the osteoblast［J］.Life Sci，2015，(123):72-77.

［7］Chen ZW，Wu ZX，Sang HX，et al.Effect of aspirin administration for the treatment of osteoporosis in ovariectomized rat model［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91(13):925-929.

［8］Guo Y，Zhang CY，Tian Y，et al.Effect of cyclooxygenase-2 on bone loss in ovariectomized rats［J］.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2012，47(6):458-462.

［9］Li CJ，Chang JK，Wang GJ，et al.Constitutively expressed COX-2 in osteoblasts positively regulates Akt signal transduction via suppression of PTEN activity［J］.Bone，2011，48(2):286-297.

［10］Fracon RN，Teofilo JM，Satin RB，et al.Prostaglandins and bone:potential risks and benefits related to the use of nonsteroidal antiinflammatory drugs in clinical dentistry［J］.J Oral Sci，2008，50(3):247-252.

［11］Ogata N，Chung UI，Tei Y，et al.Optimization of signaling pathways for bone regeneration［J］.Clin Calcium，2008，18(12):1707-1712.

［12］Chae YM，Heo SH，Kim JY，et al.Upregulation of smpd3 via BMP2 stimulation and Runx2［J］.BMB Rep，2009，42(2):86-90.

［13］Urganus AL，Zhao YD，Pachman LM.Juvenile dermatomyositis calcifications selectively displayed markers of bone formation［J］.Arthritis Rheum，2009，61(4):501-508.