HPLC法測定柴胡桂枝顆粒中桂皮醛和桂皮酸的含量

范廣建 張堅(jiān)

柴胡桂枝湯為小柴胡湯和桂枝湯的合方，主要用于太陽少陽合病引起的發(fā)熱惡寒、肢體疼痛等癥［1］。柴胡桂枝湯在現(xiàn)代臨床應(yīng)用也十分廣泛，主要用于治療 發(fā) 熱［2-9］、循 環(huán) 系 統(tǒng) 病 癥［10-13］、消 化 系 統(tǒng) 病癥［14-20］、內(nèi)分泌系統(tǒng)病癥［21］、植物神經(jīng)功能紊亂［22］及婦科疾?。?3］等。由于傳統(tǒng)湯劑煎煮麻煩、服用劑量大、不方便攜帶及口味難以下咽，而中藥配方顆粒具有劑量準(zhǔn)確、即沖即服和貯存攜帶方便等特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)中藥飲片調(diào)配稱量不夠準(zhǔn)確、服用劑量不易掌握、易污染等缺點(diǎn)［24］。故而在柴胡桂枝湯的基礎(chǔ)上經(jīng)過工藝優(yōu)化開發(fā)了柴胡桂枝顆粒，但現(xiàn)有柴胡桂枝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對黃芩中的黃芩苷進(jìn)行了含量測定，但對君藥柴胡和桂枝的指標(biāo)性成分的含量測定尚未見報(bào)道，作者采用HPLC法建立了同時測定君藥桂枝中的桂皮酸和桂皮醛的含量的方法，由此為柴胡桂枝顆粒提供了一種簡單、準(zhǔn)確地質(zhì)量控制手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀及工作站(美國Agilent公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);AS系列超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 柴胡桂枝顆粒(由本院研發(fā)中心提供，批號為 091401，091403，091404，091405)，桂皮酸、桂皮醛對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)，乙腈、冰醋酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為蒸餾水，甲醇為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品貯備液的制備:取桂皮酸對照品12.65 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1毫升中含桂皮酸0.25 mg)。精密稱取桂皮醛對照品10.60 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1毫升中含桂皮酸1.06 mg)。

2.1.2 供試品溶液的制備:取本品適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50.0 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率400 W，頻率25 kHz)30 min，放至室溫后，再稱定質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液1.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備:按照柴胡桂枝顆粒的處方及制備工藝，制備不含桂枝的陰性樣品，按2.1.2項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相:乙腈-1.0%醋酸水溶液(30∶70)，檢測波長290 nm，流1.0 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl，柱溫:35℃。在此條件下，理論塔板數(shù)(N)按桂皮酸峰計(jì)算為5 000，按桂皮醛峰計(jì)算為3 900。桂皮酸和桂皮醛色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5。結(jié)果顯示，在上述波長下樣品色譜峰分離度很好，并且陰性供試品溶液對桂皮酸和桂皮醛的測定無干擾。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢測波長測定:以流動相為空白對照，在200～400 nm范圍內(nèi)對桂皮酸和桂皮醛對照品稀釋液進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，桂皮酸和桂皮醛均在290 nm處有最大吸收峰，故以290 nm為檢測波長。

2.3.2 線性關(guān)系考察:精密吸取桂皮酸對照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml分別置 50 ml量瓶中，再依次分別精密加入桂皮醛對照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml于相應(yīng)的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取20 μl進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到桂皮酸的回歸方程為Y=147.23X+4.3834，相關(guān)系數(shù)r=0.9997，桂皮酸的回歸方程為Y=103.75X+11.1370，相關(guān)系數(shù)r=0.9992，結(jié)果表明桂皮酸在 2.024～12.144 μg/ml，桂皮醛在 8.480 ～ 50.880 μg/ml與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 專屬性考察:分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照樣品溶液各20 μl進(jìn)樣，分別記錄其色譜圖。在“2.2”色譜條件下，供試品中桂皮酸和桂皮醛的色譜峰與對照品中這兩種成分的色譜峰保留時間均一致，桂皮酸和桂皮醛與樣品中其他成分分離度均大于1.5，且陰性樣品溶液中在相應(yīng)的位置沒有色譜峰干擾，由此表明本方法的專屬性良好。見圖1～3。

圖2 供試品溶液色譜圖1:桂皮醛;2:桂皮酸

圖3 陰性樣品溶液色譜圖

2.3.4 精密度試驗(yàn):取含有桂皮醛6.072 μg/ml和桂皮酸25.440 μg/ml的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，分別記錄其峰面積，測得桂皮醛的 RSD=1.19%(n=5)，桂皮酸的 RSD=1.05%(n=5)。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號091403)樣品溶液按2.2項(xiàng)下色譜條件，1 d內(nèi)平行操作6份，測得桂皮酸的含量 RSD=1.06%(n=6);桂皮醛的含量RSD=0.95%(n=6)，結(jié)果顯示方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為4 g/L(批號091403)樣品溶液按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別于1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，共測6次，求得桂皮酸的峰面積RSD=1.19%(n=6)，桂皮醛的峰面積 RSD=1.30%(n=6)，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 檢測限和定量限:取含桂皮酸2.024 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液和桂皮醛8.480 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，分別逐級稀釋，以信噪比(S/N)3確定檢測限，以信噪比(S/N)10確定定量限，桂皮酸和桂皮醛的定量限分別為0.025，0.1 μg/ml;桂皮酸和桂皮醛的定量限分別為0.15，0.2 μg/ml。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn):精密稱取已測定含量的柴胡桂枝顆粒(批號091403)樣品6份，每份0.25 g，分別精密加入濃度為0.253 mg/ml桂皮醛對照品貯備液及濃度為1.060 mg/ml桂皮酸對照品貯備液各1 ml，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，計(jì)算平均回收率，測得桂皮酸的平均回收率為99.73%，RSD=1.83%(n=6);桂皮醛的平均回收率為100.09%，RSD=1.39%(n=6)。見表1。

表1 桂皮酸和桂皮醛的回收率

2.4 樣品的測定 取4個不同批號的柴胡桂枝顆粒，按2.1.2項(xiàng)下處理，依照2.2項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行含量測定，每份樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算平均值。見表2。

表2 桂皮酸和桂皮醛的含量測定結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)中采用的色譜條件是參考《中國藥典》2010版“桂枝”含量測定項(xiàng)下的流動相為:乙腈:0.1%冰醋酸(33∶67)［25］，但是抑制拖尾效果不是很明顯，而且桂皮酸和桂皮醛的分離度不理想，故而在此基礎(chǔ)上稍作了調(diào)整，流動相定為:乙腈:1.0%冰醋酸(30∶70)。

本實(shí)驗(yàn)考察了超聲提取法和回流提取法對樣品中桂皮酸和桂皮醛含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取方式得到的桂皮酸含量相差不大，但是桂皮醛的含量差異很大，超聲提取法得到的桂皮醛含量較高，所以確定提取方式為超聲提取。在對樣品中桂皮酸和桂皮醛的提取條件的考察中分別對甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇幾種提取溶劑進(jìn)行了分析比較，結(jié)果顯示甲醇提取的桂皮酸含量最高，70%甲醇提取的桂皮醛含量最高，但是甲醇和70%甲醇提取的桂皮醛的含量相差不大，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

提取溶劑的體積也較大程度地影響提取效果，因此對提取溶劑的體積進(jìn)行了考察，分別采用10、25、40 ml的甲醇溶液對樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果顯示25 ml和40 ml甲醇溶液提取出的桂皮酸和桂皮醛的含量相差不大，因此選擇25 ml作為提取溶液的體積。及此外又對超聲提取的時間進(jìn)行了考察，比較了提取20、30、40 min桂皮酸和桂皮醛的含量，結(jié)果顯示提取30 min和40 min兩種成分含量沒有太大區(qū)別，所以提取時間定為30 min。

采用HPLC法對柴胡桂枝顆粒中桂皮酸和桂皮醛的含量進(jìn)行測定，方法學(xué)研究結(jié)果表明此方法簡單可行，準(zhǔn)確度和靈敏度高，重復(fù)性好等指標(biāo)均符合要求。

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