圓葉大黃的化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性初步研究

付深振 戴聞韜， 費(fèi) 燁 彭江南 閆興麗 高增平

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100102； 2 University of Texas Health Science Center at San Antonio，Texas 78229，USA)

圓葉大黃的化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性初步研究

付深振1戴聞韜1，2費(fèi) 燁1彭江南2閆興麗1高增平1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100102； 2 University of Texas Health Science Center at San Antonio，Texas 78229，USA)

目的：研究圓葉大黃(RheumTataricumL.F.)的化學(xué)成分及主要成分的細(xì)胞毒活性。方法：采用silica gel、Sephadex LH-20、HPLC等色譜法對圓葉大黃80﹪乙醇提取物進(jìn)行分離純化，通過LC/MS，1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR和薄層色譜檢識(shí)等技術(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定化合物的結(jié)構(gòu)；運(yùn)用SRB法對分離得到的主要成分進(jìn)行Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒活性篩選。結(jié)果：從圓葉大黃中分離鑒定出11個(gè)化合物，分別為大黃酚(1)，大黃素(2)，大黃素甲醚(3)，蘆薈大黃素(4)，Rheosmin(5)，1，3，8-trihydroxyanthraquinone(6)，β-谷甾醇(7)，胡蘿卜苷(8)，大黃素-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside(9)，大黃素甲醚-8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside(10)，大黃酚-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside(11)；對化合物4、5、6、9、10、11進(jìn)行了細(xì)胞毒活性篩選，其中化合物4、6、9、10、11均對Hela細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，化合物5對Hela細(xì)胞無細(xì)胞毒活性。結(jié)論：8個(gè)化合物(化合物4-11)均為首次從該植物中分離得到，5個(gè)化合物對Hela細(xì)胞有細(xì)胞毒活性，且化合物5，6，9，10，11均為首次對Hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選。

圓葉大黃；化學(xué)成分；細(xì)胞毒活性

圓葉大黃(RheumTataricumL.F.)為蓼科(Polygonaceae)大黃屬多年生中型草本植物，別名韃靼大黃，在我國主要分布于新疆西部地區(qū)，另在阿富汗、俄羅斯、哈薩克斯坦也有分布[1]，在俄羅斯當(dāng)?shù)乜勺鍪卟耸秤肹2]，在我國尚未有食用和藥用價(jià)值的相關(guān)報(bào)道。但是在西藏市場上發(fā)現(xiàn)其作為藏藥塔黃有銷售。塔黃為蓼科大黃屬高山大黃[3-5](RheumnobileHook.f.et Thoms)的根和根莖，產(chǎn)于西藏喜馬拉雅山麓及云南西北部，在藏醫(yī)中用于治療黃水[3，6]、惡性腹水、腎水腫、“培根”病[7-8]等，在印度、錫金等國也被廣泛作為藥用[9]。對于究竟圓葉大黃能否代替塔黃入藥尚未見相關(guān)研究報(bào)道，因此本課題組在研究藏藥塔黃的基礎(chǔ)上初步探索了圓葉大黃的化學(xué)成分和其主成分的細(xì)胞毒活性，為全面對比藏藥塔黃與圓葉大黃的化學(xué)成分和藥理活性，確保藏藥塔黃的用藥安全和有效奠定基礎(chǔ)。

1 藥材、儀器及試藥

藥材：購自西藏拉薩，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利副教授鑒定為蓼科大黃屬圓葉大黃RheumTataricumL.F.的根莖。儀器：Bruker-Avance VNS-600和Bruker AVANCE-III-500 mHz型核磁共振儀，Waters高效液相色譜儀，薄層色譜硅膠及柱色譜硅膠均為青島海洋化工廠生產(chǎn)，AB-8型大孔樹脂為天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)，Sanyo CO2Incubator，Molecular Devices Spectra max。試劑：所用試劑均為分析純。Hela細(xì)胞購自于American Type Culture collection，Basal Medium eagle，trypsin購自于Sigma Life Science。

2 提取和分離

藥材粗粉10 kg，80%乙醇回流提取三次，2 h/次。減壓回收溶劑得到浸膏，加水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到五個(gè)部位。石油醚部位，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離及重結(jié)晶，得到化合物1(891.4 mg)，化合物2(16.5 mg)，化合物3(86.6 mg)，化合物4(41 mg)，化合物5(5 mg)。乙酸乙酯部位，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，HPLC以及重結(jié)晶，得到化合物6(25 mg)，化合物7(10 mg)，化合物8(84.4 mg)，化合物9(30 mg)，化合物10(20 mg)，化合物11(5 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，化合物2，化合物3，化合物7，化合物8經(jīng)與對照品進(jìn)行TLC對比(三個(gè)溶劑展開系統(tǒng))，分別為大黃酚，大黃素，大黃素甲醚，β-谷甾醇和胡蘿卜苷，化合物5經(jīng)1H-NMR(600 mHz，DMSO)確定其結(jié)構(gòu)為Rheosmin?；衔?：黃色結(jié)晶。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.261(1H，s，H-2)，7.651(1H，s，H-4)，7.684(1H，d，J=7.2 Hz，H-5)，7.778(1H，t，J=7.8Hz，H-6)，7.345(1H，d，J=8.4 Hz，H-7)。13C-NMR(600 MHz，DMSO)δ：161(C-1)，120.5(C-2)，153.7(C-3)，117.1(C-4)，119.2(C-5)，137.4(C-6)，123.7(C-7)，161(C-8)，191.4(C-9)，181(C-10)，114.5(C-11)，135.1(C-12)，114.4(C-13)，136.5(C-14)。以上數(shù)據(jù)與蘆薈大黃素文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[10-11]，故鑒定該化合物為蘆薈大黃素?；衔?：黃色粉末。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.748(1H，s，H-2)，8.134(1H，s，H-4)，7.737(1H，d，J=6.6 Hz，H-5)，7.827(1H，t，J=6.6 Hz，H-6)，7.411(1H，d，J=7.2 Hz，H-7)。13C-NMR(600 MHz，DMSO)δ：161.6(C-1)，124.4(C-2)，166.2(C-3)，119.4(C-4)，119.9(C-5)，138.1(C-6)，125.2(C-7)，161.8(C-8)，191.9(C-9)，181.8(C-10)，111.8(C-11)，133.8(C-12)，119.1(C-13)，139.7(C-14)。以上數(shù)據(jù)與1，3，8-trihydroxyanthraquinone的文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定該化合物為1，3，8-trihydroxyanthraquinone?；衔?：黃色粉末。ESI-MS：m/z 474[M]+，497[M+Na]+；1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：6.949(1H，s，H-2)，7.289(1H，s，H-4)，7.445(1H，s，H-5)，7.147(1H，s，H-7)，5.218(1H，d，H-1')，3.450(1H，dd，J=5.4，7.2Hz，H-2')，3.29-3.376(H-3'，H-4' overlapped with H2O)，3.686(1H，J=1.2，7.2，10.2 Hz，H-5')，4.100(1H，J=6.0，10.2Hz，H-6')，4.309(1H，J=7.2，10.2Hz，H-6')。以上數(shù)據(jù)與emodin-8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside的文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定該化合物為emodin-8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside。化合物10：黃色粉末。ESI-MS：m/z 488[M]+，511[M+Na]+；1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.151(1H，s，H-2)，7.392(1H，s，H-4)，7.463(1H，s，H-5)，7.126(1H，s，H-7)，5.219(1H，d，J=6.6 Hz，H-1')，3.482(1H，dd，J=4.3，6.6 Hz，H-2')，3.300(1H，t，J=4.3 Hz，H-3')，3.243(H-4'，overlapped with water)，3.752(1H，ddd，J=2.6，6.2，9.3 Hz，H-5')，4.056(1H，dd，J=6.2，9.3 Hz，H-6')，4.348(1H，dd，J=2.6，9.3 Hz，H-6')。以上數(shù)據(jù)與physcion-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside的文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定該化合物為physcion-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside ?；衔?1：黃色粉末。ESI-MS：m/z 458[M]+，481[M+Na]+；1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：2.007(3H，s，-OAc)，2.48(3H，s，Me)，7.497(1H，s，H-2)，7.725(1H，s，H-4)，7.633(1H，d，J=0.6 Hz，H-5)，7.725(1H，br.s，H-6)，7.317(1H，d，J=6.0 Hz，H-7)，5.219(1H，d，J=6.6 Hz，H-1')，3.489(1H，dd，J=4.2，6.6 Hz，H-2')，3.357(1H，t，J=4.2 Hz，H-3')，3.250(H-4'，overlapped with H2O)，3.723(1H，ddd，J=2.4，6.0，9.0 Hz，H-5')，4.050(1H，dd，J=6.0，9.0Hz，H-6')，4.362(1H，dd，J=2.4，9.0 Hz，H-6')，12.940(s，OH-8)。以上數(shù)據(jù)與，chrysophanol-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside的文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定該化合物為chrysophanol-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside。

4 細(xì)胞毒活性篩選

4.1 試驗(yàn)方法 Hela細(xì)胞BME(Basal Medium Eagle)培養(yǎng)基，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h后，分別加入濃度為20 μg/mL的化合物4，化合物5，化合物6，化合物9，化合物10，化合物11，DMSO為對照。給藥后置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h，然后采用SRB法[15-16]進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選及分析。

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)SRB法分析，結(jié)果化合物5對Hela細(xì)胞沒有細(xì)胞毒活性，另外5個(gè)化合物對Hela細(xì)胞有不同程度的細(xì)胞毒活性。其中活性最強(qiáng)的是化合物4，細(xì)胞數(shù)為對照(DMSO)的20.6%，活性最弱的為化合物9，細(xì)胞數(shù)為對照的90.1%，化合物6，10和11的細(xì)胞數(shù)分別為對照的35.5%，52.57%和53.0%。

5 總結(jié)與討論

通過對圓葉大黃的化學(xué)成分進(jìn)行初步研究，共得到11個(gè)化合物，其中8個(gè)化合物(化合物4-11)為首次從該植物中分離得到，進(jìn)而為圓葉大黃與塔黃的化學(xué)成分對比提供了部分依據(jù)；對其中的六個(gè)化合物進(jìn)行針對Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的初步篩選，SRB分析結(jié)果為其中化合物4、6、9、10、11對Hela細(xì)胞有不同程度的細(xì)胞毒活性，化合物5對Hela細(xì)胞無細(xì)胞毒活性，這為圓葉大黃與塔黃的藥理活性對比提供依據(jù)；五個(gè)對Hela細(xì)胞有細(xì)胞毒活性的化合物均為蒽醌或其苷類，這將為進(jìn)一步的研究蒽醌及其苷類化合物的細(xì)胞毒活性奠定基礎(chǔ)。總之，通過對圓葉大黃化學(xué)成分及部分成分的細(xì)胞毒活性研究，為其進(jìn)一步的與塔黃進(jìn)行比較研究奠定基礎(chǔ)，從而確定圓葉大黃是否可以代替藏藥塔黃使用，以確保藏藥塔黃的市場規(guī)范和用藥安全。

[1]中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1998:199.

[2]Chumbalov，T.K.Results of studying the chemical composition of Kazakhstan vegetable raw material[J].Khimiyai Khimicheskaya Tekhnologiya，1970，71(1):150.

[3]國家中醫(yī)藥管理局編委會(huì).中華本草·藏藥卷[M].上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1999:260.

[4]Bo Song，Zhang Zhi-qing，Jürg St?cklin，et al.Multifunctional bracts enhance plant fitness during flowering and seed development in Rheum nobile(Polygonaceae)，a giant herb endemic to the high Himalayas[J].Oecologia，2013(172):359-370.

[5]Ichiro Terashima，Takehiro Masuzawa，Hideaki Ohba.Photosynthetic characteristics of a giant alpine plant，Rheum nobile Hook.f.et Thoms and of some other alpine species measured at 4300 m，in the Eastern Himalaya，Nepal[J].Oecologia，1993，95(2):194-201.

[6]阿召.淺論藏醫(yī)“黃水證”[J].西部中醫(yī)藥，2011，24(8):63-64.

[7]宇妥·云丹貢布.四部醫(yī)典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987:77.

[8]才項(xiàng)仁增.淺談藏醫(yī)三因?qū)W之培根及培根病[J].西部中醫(yī)藥，2011，24(7):58-60.

[9]P.Prasad，L.K.Rai，H.Birkumar Singh.Folk Medicinal Plants in the Sikkim Himalayas of India[J].Asian Folklore Studies，2002(61):295-310.

[10]Danielsen，Knut；Aksnes，Dagfinn W.NMR study of some anthraquinones from Rhubarb.Magnetic Resonance in Chemistry，1992，30(4)：359-360.

[11]魏玉輝，張承忠，李沖，等.光莖大黃化學(xué)成分研究(Ⅰ)[J].中草藥，2004，35(7):732-734.

[12]Anslow，W.K.B，reen，J，Raistrick，H.1，3，8-trihydroxyanthraquinone[J].Journal of the chemical society，1940:427-428.

[13]Ya Qinshi，Toshio Fukai et al.Cytotoxic and DNA damage-inducing actives of low molecular weight phenols from Rhubarb.Anticaner research，2001，21(4a)：2847.

[14]Qi Huan.Three new anthraquinones from Polygonum cillinerve .Chinese chemical letters，2005，16(8)：1050.

[15]Philip Skehan，Ritsa Storeng et al.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].Journal of the National Cancer Institute，1990，82(13):1107-1112.

[16]Vichai V，Kirtikara K.Sulforhodamine B colorimetric assay forcytotoxicity screening[J].Nature Protocol，2006，1(3):1112-1116.

(2014-03-09收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

Primary Study on Chemical Constituents of Rheum Tataricum L.F.and Their Cytotoxic Activity

Fu Shenzhen1，Dai Wentao1，2，F(xiàn)ei Ye1，Peng Jiangnan2，Yan Xingli1，Gao Zengping1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China; 2UniversityofTexasHealthScienceCenteratSanAntonio，Texas78229，USA)

Objective： To investigate the chemical constituents of the Rheum Tataricum and evaluate some of the compounds for cytotoxic activity against Hela cell.Methods:Silica gel，Sephadex LH-20 column，chromatography High Performance Liquid Chromatography methods were used to do isolation.The structures of isolates were confirmed by spectral (LC/MS，1H-NMR，13C-NMR，2DNMR，thin-layer chromatograph) analysis and by comparison with the literature reports; Cytotoxic activities were determined by the SRB method.Results:Eleven compounds were gained and they were chrysophanol (1)，emodin(2)，Physcion (3)，Aloe-emodin (4)，Rheosmin (5)，1，3，8-trihydroxyanthraquinone (6)， Sitosterol (7)， Daucosterol (8)，emodin8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside (9)，physcion1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside (10)，chrysophanol1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside (11); six compounds were evaluated for cytotoxic activities，five of them showed cytotoxic activity against Hela cell，and they were Aloe-emodin，1，3，8-trihydroxyanthraquinone，emodin8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside，physcion1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside，chrysophanol1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside，rheosmin has no activity.Conclusion:Eight (compound 4-11)of them are isolated from Rheum nobile for the first time; five of the compounds show cytotoxic activities，compound5，6，9，10，11are evaluated for cytotoxic activities against Hela cell for the first time.

Rheum Tataricum; Chemical consitutents; Cytotoxic activity

R28

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.029