低溫脅迫對甜瓜幼苗葉片保護酶活性的影響

摘要：本研究選擇新疆吐魯番地區(qū)栽植面積比較大的西州密25號為試材，通過-5℃、0℃和常溫三個處理，分別于處理后24小時、48小時、72小時、96小時、120小時測定其葉片SOD和POD酶的活性，研究低溫脅迫對甜瓜幼苗葉片保護酶活性的影響。結(jié)果表明：-5℃以下的甜瓜葉片隨著低溫脅迫時間的延長，依然保持較高的酶活性，這可能是SOD和POD保護酶活性的耐寒機制已形成，當(dāng)處理96小時，酶活性達到最高，這是低溫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，使其能比在0℃和常溫下更有效地清除體內(nèi)的有毒物質(zhì)，保護植物免受傷害或減少傷害。但到96小時后，酶活性開始呈下降趨勢，隨著低溫時間的延長甜瓜有受凍害的可能，因此在甜瓜栽植，遇到冷害時溫度和時間都是要必須考慮的因素。

關(guān)鍵詞：低溫脅迫；甜瓜；幼苗；酶活性

項目名稱：鄯善縣哈密瓜主要病蟲害綜合防控技術(shù)

中圖分類號： S652 文獻標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.04.034

甜瓜原產(chǎn)于印度、非洲熱帶沙漠地區(qū)，為葫蘆科甜瓜屬一年生蔓生作物。甜瓜屬于冷敏感作物，近年來，隨著甜瓜反季節(jié)以及早熟設(shè)施栽培技術(shù)發(fā)展迅速，甜瓜冷害問題也日益突出，成為甜瓜栽培生產(chǎn)的主要障礙之一[1-4]。特別是在我國甜瓜栽植面積比較大的新疆吐魯番地區(qū)常常會在春季出現(xiàn)倒春寒或者夏季溫度突降的現(xiàn)象，在很大程度上影響了甜瓜的栽植。在早春時節(jié)突遇倒春寒將對3月份的甜瓜定植苗造成嚴(yán)重傷害，后期會嚴(yán)重影響甜瓜品質(zhì)、產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，可見研究甜瓜的抗寒性對甜瓜反季節(jié)以及設(shè)施栽培的穩(wěn)定發(fā)展，提高甜瓜的生產(chǎn)效益具有重要的現(xiàn)實意義。

1材料與方法

1.1材料

于2014年6～7月選擇新疆吐魯番地區(qū)主栽的甜瓜品種西州密25號為試材，采集葉片帶回實驗室，混勻后隨機分組進行三個處理：常溫，0℃，-5℃。

1.2方法

將葉片采摘下來0小時的時候先測定SOD酶和POD酶的活性，然后每隔24小時分別測定葉片SOD酶的活性，連續(xù)測定5天，時間分別是24小時，48小時，72小時，96小時，120小時。

1.2.1 SOD酶活性的測定

酶液提取。在處理時間到后，每次分別準(zhǔn)時從每個處理中隨機取出數(shù)個葉片，用軟紙將葉片表面的灰塵拭擦干凈，除去主脈后用剪刀將葉片剪碎。隨機稱取0.5克放置于預(yù)冷的研缽中，加入適量的石英沙和2毫升已預(yù)冷的磷酸緩沖液（其中含1%的PVP）在冰浴上研磨成勻漿并轉(zhuǎn)移至離心管中，接著再分別加入磷酸緩沖液2次，每次2毫升沖洗殘留在研缽中的漿液后也轉(zhuǎn)移到離心管中。每兩只離心管平衡后，對稱放入離心機中在4℃的條件下，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，其上清液即為SOD粗提取液（顯色反應(yīng)見表1）。

表1 SOD酶的顯色反應(yīng)

各種試劑依次加入以后立即震蕩搖勻，快速地用黑色塑料袋將其中一支對照管多層纏繞包嚴(yán)，和另外三支試管同時置于4000lx日光燈下反應(yīng)10分鐘（要求各試管照光條件一致，反應(yīng)溫度控制在25℃～35℃）。

SOD活性的測定。反應(yīng)時間到，立即將試管從光源處取出，用黑布罩蓋試管，以終止反應(yīng)。以遮光的對照管為空白，用721分光光度計在560納米處測定各反應(yīng)液的吸光度（OD值），利用測得的數(shù)據(jù)計算SOD活性的大小。

1.2.2 POD酶活性的測定

酶液提取。采用愈創(chuàng)木酚法，依次取三種溫度下處理的葉片，擦干凈，大葉片去葉脈，剪碎。用萬分之一天平分別稱取不同溫度處理下的葉片0.5克，分別放入冰凍的研缽中，研磨前加入2毫升的磷酸緩沖液及少許石英沙，進行冰浴研磨，研磨成勻漿狀，再加入2毫升的磷酸緩沖液轉(zhuǎn)移到離心管中，最后加入2毫升磷酸緩沖液沖洗研缽，通過加石英沙進行調(diào)平，放入低溫下準(zhǔn)備離心。提前將離心機制冷打開，將調(diào)平后的離心管放入離心機中，以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，提取酶液低溫儲藏。

酶活性測定。用三個試管分別取2.9毫升0.05摩爾/升pH 7.8的磷酸緩沖液，1.0毫升0.05摩爾/升的愈創(chuàng)木酚溶液，0.2毫升酶液，1.0毫升2%雙氧水，以煮過失活的酶液為對照，反應(yīng)體系加入酶液后放入34℃的水浴鍋水浴3分鐘，水浴后迅速加入2毫升 20%三氯乙酸（終止反應(yīng)液），用721分光光度計470納米波長下測吸光度，利用測得的數(shù)據(jù)計算POD活性的大小[5]。

2結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理甜瓜葉片SOD酶活性的變化

由圖1可以看出：在-5℃的條件下，SOD酶的活性在處理24小時后，開始上升，48小時時依然處于上升的狀態(tài)，在處理72小時后，SOD酶活性達到最大。而后在96小時時開始劇烈的下降，在120小時后其活性已經(jīng)非常低。在常溫的處理條件下：SOD酶的活性變化比較平緩。說明在經(jīng)受-5℃的低溫脅迫以后，SOD酶的活性隨處理時間上升，酶的保護機制形成并發(fā)揮作用，在72小時時達到最大。說明酶的應(yīng)激機制在外界的低溫刺激下形成，對不良外界條件發(fā)揮抵抗作用。但是隨著低溫脅迫時間的延長，SOD酶的活性降低甚至失活，這種酶的保護機制被破壞，其抵抗低溫的能力也隨著減弱和消失。

2.2 不同低溫處理甜瓜葉片POD酶活性的變化

由圖2可知，POD過氧化物酶的活性在-5℃處理下的欒樹葉片的酶活性變化幅度較大，0℃下的次之，常溫下的相對穩(wěn)定。同一處理下不同時間的整體表現(xiàn)為先上升后下降的動態(tài)趨勢。3個不同溫度處理下的甜瓜葉片POD酶活性在96小時均達到最高值，然后開始下降，同樣說明隨著低溫脅迫時間的延長，POD酶的活性降低甚至失活。

3小結(jié)與討論

當(dāng)植物處于低溫逆境脅迫時，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡遭到破壞，大量的活性氧不能及時清除而在細(xì)胞內(nèi)積累對細(xì)胞造成氧化損傷，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)，膜脂，DNA及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷，并直接攻擊葉綠體、線粒體等細(xì)胞器，使植物生長發(fā)育受到影響。高濃度氧對植物細(xì)胞傷害的另一個重要原因是引起膜的過氧化作用。超氧物歧化酶即SOD是需氧生物體內(nèi)普遍存在的一種含金屬酶。是植物酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶，它能夠防御或減輕活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，保護正常的代謝，因此其活性的大小與植物的抗寒性密切相關(guān)[6-7]。另外不少研究已經(jīng)證明，過氧化物酶POD作為植物低溫脅迫中的膜保護酶，在植物遭受低溫逆境時，迅速清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，如活性氧自由基及過氧化物，消除或減輕低溫對植物的傷害，從而提高植物的抗寒力。POD能催化H2O2與酚類的反應(yīng)，從而有效地阻止自由基在植物體內(nèi)積累，使細(xì)胞內(nèi)自由基維持在一個低水平，防止細(xì)胞受自由基的毒害。逆境下植物產(chǎn)生更多的氧自由基，加劇了膜脂過氧化從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，最終組織受到破壞。POD酶是植物對膜脂過氧化的酶促防御系統(tǒng)中重要的保護酶，POD酶在保護酶系統(tǒng)中主要是起到酶促降解H2O2的作用，從而使植物抵抗在逆境脅迫下代謝過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，表現(xiàn)出一定的抗逆性。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧與防御系統(tǒng)之間保持著平衡[8-10]。本試驗中-5℃以下的甜瓜葉片隨著低溫脅迫時間的延長，依然保持較高的酶活性，這可能是SOD和POD保護酶活性的耐寒機制已形成，能夠使活性氧代謝處于一定的平衡，避免了活性氧等各種自由基的大量積累，減輕了膜脂過氧化作用，降低了細(xì)胞膜的破壞程度。當(dāng)處理96小時，酶活性達到最高，這是低溫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，使其能比在0℃和常溫下更有效地清除體內(nèi)的有毒物質(zhì)，保護植物免受傷害或減少傷害。但到96小時后，酶活性開始呈下降趨勢，隨著低溫時間的延長甜瓜有受凍害的可能，因此栽植甜瓜遇到冷害時，冷害的溫度和時間都是必須要考慮的因素，及時采取防凍保溫措施，防止低溫對甜瓜幼苗危害的發(fā)生[11-12]。

參考文獻

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作者簡介：袁森，本科學(xué)歷，新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，高級農(nóng)藝師，研究方向：葡萄栽培和西甜瓜栽培，及病蟲害防治等。endprint