常用染色體分析技術在產(chǎn)前診斷中的應用

黃寧綜述，劉艷秋審校

(江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江西 南昌 330006)

產(chǎn)前診斷學是一個正迅速發(fā)展，技術不斷完善的新領域，對提高人口素質，實行優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。染色體分析是產(chǎn)前診斷中一項重要的常用檢測手段，如何對細小的染色體異常做出準確的核型分析一直是困擾產(chǎn)前診斷技術人員的技術難題之一。隨著技術的不斷發(fā)展，染色體分析方法已在傳統(tǒng)的顯帶核型分析的基礎上，開發(fā)了熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)，比較基因組分析 (comparative genomic hybridization，CGH)、光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)。

1 常規(guī)顯帶核型分析及應用

自20世紀70年代以來染色體顯帶核型分析一直是產(chǎn)前細胞遺傳學診斷染色體病的標準方法，中期染色體標本經(jīng)特殊處理后，能顯現(xiàn)出著色深淺不同的橫紋，通過常規(guī)的核型分析技術我們可以檢測出許多染色體數(shù)目和結構異常[1]。常用的顯帶方法有 G、R、C、Q、N、T等分帶方法。 以 G 顯帶最為常見，可以檢出300~1000條帶階段染色體的結構異常，R顯帶與G顯帶條紋正好相反，有利于顯示染色體末端缺失、重排。但在許多復雜的病例如染色體微小結構易位、非平衡易位、環(huán)形染色體、微小片段的插入、標記染色體和復雜的結構異常，通過傳統(tǒng)的染色體顯帶核型往往不能發(fā)現(xiàn)或難以準確定位異常染色體的片段來源，對于復雜異常染色體的診斷常常比較困難。

2 F I S H及應用

FISH是一門新興的分子遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術?，F(xiàn)已廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。其技術原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，與待檢染色體中單鏈核酸按照堿基互補原則進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，從而將特定基因在染色體上定位。FISH技術靈敏度及特異性高，能檢測染色體微小缺失及重排，標本來源豐富，間期細胞、分裂中期細胞、分化或未分化細胞及死亡細胞皆可以被檢測，且能迅速得到結果[2]。但FISH技術依賴于已知的染色體異常，對通過G顯帶技術初步分析但不能確診的異常染色體有重要應用價值。同時FISH只能檢測一個或少數(shù)幾個染色體異常，對染色體的增加比較敏感，而對染色體的缺失不甚敏感，當缺乏復雜標記染色體探針時，就難以對未知的異常染色體進行核型分析。Tepperberg等[3]對5348例有產(chǎn)前診斷指征的孕婦選用13、18、21、X染色體特異性探針進行未培養(yǎng)的羊水間期細胞分析，并與羊水中期細胞培養(yǎng)結果進行對照。FISH分析成功的5197例，占總數(shù)的97.2%，與中期羊水染色體細胞培養(yǎng)結果一致率為99.8%。對所有發(fā)現(xiàn)的非整倍體，F(xiàn)ISH的敏感性為99.6%，特異性99.9%。羊水細胞培養(yǎng)染色體分析聯(lián)合FISH技術快速、靈敏度較高、特異性較強，對于非整倍體產(chǎn)前診斷具有重要意義。

3 C G H及應用

CGH技術是在FISH 基礎上結合消減雜交技術發(fā)展起來的一種新的分子細胞遺傳學技術，該技術利用兩種不同的熒光分別標記待檢組織基因組DNA和正常組織基因組DNA，再同時與正常淋巴細胞中期染色體進行雜交的過程，借由此比較染色體上不同熒光間的強弱比值，來檢測基因組中特定基因的拷貝數(shù)變異。它通過單一的一次雜交可對整個基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化進行檢查，還能確定一些常規(guī)顯帶法已發(fā)現(xiàn)的異常染色體定位?？捎糜跈z測組織DNA異常如缺失、擴增、復制，并在染色體上定位。CGH能全面觀察染色體獲得缺失情況，了解染色體臂或區(qū)帶的增加或缺失[4,5]。其缺點是只能檢測待檢基因組中相對正?；蚪M平均拷貝數(shù)的變化，而不能檢測易位、倒位及其他拷貝數(shù)沒有變化的染色體異常，對微小的重復、缺失檢測不出。陽鑫妙等[6]對1例5條染色體發(fā)生復雜易位的胎兒作出產(chǎn)前診斷，羊水細胞染色體結果為46,XX,t(5;7;12),t(14;21)，夫妻雙方外周血染色體核型正常，應用array-CGH技術對羊水細胞進行全基因組高分辨掃描分析，了解是否有微小缺失和重復，結果顯示胎兒染色體未發(fā)生微缺失或微重復，結論提示array-CGH技術與傳統(tǒng)細胞學技術相結合，可大大提升產(chǎn)前診斷技術水平。

4 S K Y及應用

1996年Schrock[7]等在FISH的基礎上開發(fā)出SKY技術，SKY技術應用不同熒光素標記的24種全染色體涂染探針，與中期染色體進行原位雜交，使發(fā)射光譜的所有信息用于分析。這種全染色體著色技術僅需一次熒光標記雜交，一次影像攝取，一次分析，即可使每條染色體都清楚地按照不同的著色呈現(xiàn)出來，其分辨率達1.5MB大小[8]，能準確識別常規(guī)染色體顯帶法和FISH技術難以發(fā)現(xiàn)的染色體異常。為復雜的染色體結構異常，來源不明的標記染色體的診斷提供了可能。但SKY技術不能識別同一條染色體內部結構異常，如倒位，缺失或重復片段的定位[9]。Yaron等[10]用SKY技術評估5例高齡產(chǎn)婦中額外的異常結構染色體(ESACs)，發(fā)現(xiàn)用SKY技術診斷非隨體和環(huán)形染色體的異常結構染色體十分有效。

5 展望

傳統(tǒng)的染色體顯帶核型分析一直是細胞遺傳學染色體分析的金標準，具有不可替代的優(yōu)勢，應用G顯帶可以對受檢人群進行全面染色體分析，檢測46條染色體的數(shù)目異常、染色體平衡或非平衡易位、倒位等明顯的結構異常[11,12]。相繼開發(fā)出的各種分子遺傳學技術實驗周期短，同時具備更高的分辨率。FISH技術作為一項快速染色體檢測技術，可以對常見的非整倍體染色體異常作出快速檢測，正常的檢驗結果可以在1~2d內即可得到[2,13]，可以有效緩解孕婦緊張情緒。部分學者認為如產(chǎn)前診斷指征為唐氏篩查高危人群或高齡孕婦，F(xiàn)ISH可以有效地取代核型分析，但另一些學者認為一部分有臨床意義的染色體異常病例會被遺漏[14-17]，此外還存在一些FISH檢測與核型分析不一致的結果[18]。額外小標記染色體是通過常規(guī)核型分析可以發(fā)現(xiàn)，但不能確定其來源的染色體片段，必須借助其他檢測技術進行明確診斷，如aCGH、SKY[19,20]。aCGH和SKY技術作為一種新型的細胞遺傳技術，克服了傳統(tǒng)顯帶核型分析技術的缺點和FISH技術的局限，使得額外小標記染色體和染色體微小片段的插入、缺失及由此衍生的復雜結構異常的檢測成為了可能，大大提高了產(chǎn)前診斷的精確度和效率[21,22]，但同時也存在一些局限性，應與其他技術結合應用[9,23]。筆者認為，在產(chǎn)前診斷領域，聯(lián)合應用顯帶核型分析和FISH技術對高危孕婦人群進行檢測，可以滿足大部分臨床需要；而對于顯帶技術不能確定來源的標記染色體，插入片段，微小的異常染色體結構及復雜的染色體畸變，則應用SKY技術或CGH技術一目了然，再針對異常區(qū)域設計特定探針用FISH技術進一步確認，可使產(chǎn)前診斷的核型確診率和疑難核型診斷率得到提高[24,25]。隨著分子遺傳學技術的快速發(fā)展，產(chǎn)前診斷中越來越多的傳統(tǒng)核型分析無法診斷、解釋的病例得到了明確診斷，細胞遺傳學技術和分子遺傳學技術的結合、合理運用，無疑將開拓臨床應用領域。

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