姜黃素對(duì)局灶缺血再灌注損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及caspase-8的影響

李焰 劉鳳麗 王培培 左慧敏 程冉冉 周燕 李芬

腦缺血性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。腦缺血損傷所涉及的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以凋亡性死亡為主。姜黃素具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和受體等作用［1，2］。同時(shí)姜黃素在缺血性損傷中的作用越來越得到大家的認(rèn)可，在前期工作中，我們進(jìn)行了線粒體凋亡通路中Bcl2及Bax相關(guān)因子表達(dá)變化影響的研究［3］，目前此領(lǐng)域內(nèi)鮮有對(duì)外源性凋亡通路相關(guān)因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道，本研究采用小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察姜黃素對(duì)缺血再灌注損傷小鼠的caspase-8蛋白表達(dá)以及學(xué)習(xí)記憶功能的影響，從凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面深入探討姜黃素對(duì)小鼠局灶缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用的可能分子機(jī)制，為臨床神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)新藥的開發(fā)提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 131只健康雄性昆明小鼠，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(京)(2007-0001)，清潔級(jí)(SPF)，體重28～32 g，由河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前在22～25℃實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)12 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。動(dòng)物隨機(jī)分為A組:假手術(shù)組20只;B組:缺血再灌組［I/R+0.9%氯化鈉溶液(NS)］57只;C組:姜黃素治療組54只;治療組于腦缺血前1 h腹腔給予20 mg/kg姜黃素。

1.2 主要試劑 姜黃素購自美國sigma公司，用二甲基亞砜溶解配置10 mg/ml儲(chǔ)存液，避光于4℃冰箱保存;Caspase-8兔抗鼠多克隆抗體(Santa cruz biotechnology，Inc)。水迷宮(北京碩林苑科技有限公司);圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。TUNEL試劑盒(Roche)。

1.3 動(dòng)物模型的制備 本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備MCAO局灶性腦缺血再灌注模型。將頭端涂有適量硅膠的6-0單尼龍線自小鼠右側(cè)頸外動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈插入，至大腦中動(dòng)脈與大腦前動(dòng)脈分叉處(插入深度約為11 mm)，阻塞大腦中動(dòng)脈血流，造成右側(cè)大腦中動(dòng)脈所轄區(qū)缺血。模型成功標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損狀態(tài)，如不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，成追尾狀，站立不穩(wěn)，向?qū)?cè)(左側(cè))傾倒等。

1.4 腦梗死灶的測(cè)定 再灌注24 h后，小鼠斷頭取腦，續(xù)冠狀切成2 mm厚的腦片，于2%TTC中染色30 min，4%多聚甲醛固定2 h以上。計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)測(cè)量每一腦切片尾側(cè)面的梗塞面積，將各腦切片的梗塞面積乘以2 mm(腦片厚度)再相加，既為梗死灶體積。

1.5 學(xué)習(xí)和記憶功能測(cè)試 為避免小鼠腦損傷后運(yùn)動(dòng)功能障礙對(duì)水迷宮測(cè)試結(jié)果的影響，3組分別于傷后第7、8、9及10天進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將安全島隨機(jī)置于水迷宮四個(gè)象限(N、S、E、W)中的任一象限，加水(奶粉沖呈乳白色)至高過安全島10 mm，水溫保持在22～25℃，由攝象機(jī)及計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤、拍攝和統(tǒng)計(jì)大鼠分別由其他3個(gè)象限入水后尋找到安全島的軌跡和潛伏值。如在180 s內(nèi)未找到安全島，則潛伏期值記為180 s。

1.6 免疫組織化學(xué)染色及TUNEL檢測(cè) 用40 g/L多聚甲醛將小鼠進(jìn)行大循環(huán)灌流固定后，端頭取腦，于視交叉前后2 mm處選取頂葉腦組織，于40 g/L多聚甲醛中后固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，石蠟連續(xù)冠狀切片，厚5 μm，行免疫組織化學(xué)染色，一抗采用兔抗鼠多克隆抗體，陰性對(duì)照用PBS(0.01 mol/L，pH 值7.3)代替一抗孵育，根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行操作，DAB試劑盒進(jìn)行顯色，細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染。細(xì)胞凋亡TUNLE檢測(cè)步驟同說明書。光鏡下神經(jīng)元胞漿或胞核中有棕黃色顆粒的為陽性細(xì)胞。每張切片于梗死灶周圍缺血側(cè)皮層隨機(jī)選擇10個(gè)具有代表性的相互非重疊高倍視野(×400)，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，進(jìn)行半定量分析。

1.7 western blotting 檢測(cè)caspase-8蛋白表達(dá) 將小鼠端頭，取右側(cè)皮質(zhì)，每100毫克組織樣本加入1ml裂解液，低溫下組織勻漿12 000 r/min，10 min，離心后取上清液。蛋白變性后加樣于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，牛血清蛋白(BSA)封閉，加一抗兔抗鼠caspase-8、內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)4℃過夜，TBST(Tris堿 2.42 g，氯化鈉8.00 g，吐溫 20 ml，雙蒸水定容至 1 000 ml，調(diào)節(jié) pH值至7.5)洗滌3次，每次5 min，加堿性磷酸酶藕連的羊抗兔IgG，37℃ 2 h，TBST洗滌3次，加入顯色液對(duì)甲苯胺藍(lán)/氯化硝基四氮唑藍(lán)，避光顯色，至出現(xiàn)條帶后用雙蒸水終止反應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，相關(guān)性采用pearson方法兩兩相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼠腦大體形態(tài)及TTC染色結(jié)果 缺血后缺血側(cè)鼠腦腫脹，有明確的梗死灶形成，TTC染色正常腦組織呈紅色，缺血灶呈蒼白色，缺血灶與大腦中動(dòng)脈分布區(qū)域一致，證實(shí)模型制作成功，應(yīng)用姜黃素后可見明顯縮小的梗死灶。見圖1。

圖1 TTC染色梗死體積

2.2 3組小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能比較 B組第9天(P＜0.01)及第10天(P＜0.01)搜索安全島潛伏期較A組明顯延長(zhǎng)。C組第9天(P＜0.01)及第10天(P＜0.01)搜索安全島潛伏期較B組明顯縮短。見圖2。

圖2 3組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)比較

2.3 caspase-8免疫組織化學(xué)觀察 caspase-8產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于神經(jīng)元胞質(zhì)。與A組比較，B組3 h后缺血半球半影區(qū)皮質(zhì)caspase-8表達(dá)增加，12 h達(dá)高峰，24 h逐漸降低，72 h降至A組水平并持續(xù)。與B組比較，在缺血半球半影區(qū)皮質(zhì)C組中caspase-8在12 h、24 h、48 h 顯著回降(P＜0.05)。見圖 3，表1。

圖3 再灌注12 h后3組小鼠皮質(zhì)區(qū)caspase-免疫組化比較

表1 3組caspase-表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)比較±s

表1 3組caspase-表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)比較±s

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與B 組比較，#P ＜0.05

30 min 3 h 12 h 24 h 48 h 72 h A 組 4.25 ±1.21 4.01 ±1.23 3.78 ±1.22 3.88 ±1.61 4.2組別1 ±1.38 4.26 ±1.52 B 組 5.21 ±1.32 12.21 ±1.56* 32.42 ±1.78* 12.89 ±1.87* 10.36 ±1.65* 4.26 ±1.52 C 組 6.02 ±1.57 11.31 ±1.43* 16.32 ±1.43*# 7.32 ±1.72*# 5.54 ±1.83#5.51 ±1.67

2.4 western blotting檢測(cè) caspase-8蛋白表達(dá) caspase-8動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果相符，B組與A組比較，caspase-8在再灌后3 h、12 h、24 h、48 h顯著增高(P＜0.05)。C組與B組相比caspase-8 在3 h、12 h、24 h 顯著回降(P＜0.05)。見圖4。

圖4 B組和C組caspase-8免疫的蛋白表達(dá)

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 凋亡神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)凝集，核深染，呈深棕色顆粒狀。B組與A組比較，傷后3 h TUNEL陽性細(xì)胞開始顯著增加(P＜0.05)，隨著時(shí)間推移陽性細(xì)胞表達(dá)逐漸增多，傷后48 h達(dá)高峰(P＜0.05)。C組TUNEL陽性細(xì)胞各時(shí)相表達(dá)與模型組相似，但TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，C 組與 B 組比較，12 h、24 h、48 h(P＜0.05)。見表2。

表2 3組凋亡細(xì)胞數(shù)比較±s

表2 3組凋亡細(xì)胞數(shù)比較±s

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，#P ＜0.05

組別30 min 3 h 12 h 24 h 48 h 72 h A 組 1.42 ±0.28 1.41 ±0.34 1.38 ±0.22 1.47 ±0.35 1.57 ±0.24 1.50 ±0.15 B 組 1.77 ±0.46 8.92 ±1.66* 12.22 ±1.57* 18.22 ±1.07* 25.05 ±2.20* 16.05 ±1.80*C 組 1.83 ±0.35 6.60 ±1.20* 6.03 ±2.11*# 10.56 ±2.20*# 12.10 ±12.10*#15.10 ±1.40*

3 討論

缺血性腦血管疾病發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了人類的健康和生命。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以凋亡性死亡為主。也就是說腦缺血損傷與細(xì)胞凋亡的關(guān)系非常密切，因此腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的探索以及基于抗凋亡為靶點(diǎn)的抗腦缺血藥物的研發(fā)亦成為研究的熱點(diǎn)。姜黃素是從姜黃中提取的酚性色素，姜黃素的保護(hù)性作用已在心肌及全腦缺血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，其具體機(jī)制也呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應(yīng)?。?］，但其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制不祥。本室前期工作已證實(shí)姜黃素對(duì)小鼠局灶缺血再灌注有一定的保護(hù)作用［3］，為了更深入探討其抗凋亡機(jī)制本實(shí)驗(yàn)從外源性凋亡通路加以探討，以其為臨床新藥的開發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

目前，一般認(rèn)為參與缺血性腦損傷細(xì)胞凋亡調(diào)控的有三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別是線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路［5］。死亡受體通路即外源性細(xì)胞凋亡通路，TNF-α或Fas與死亡受體結(jié)合后，誘導(dǎo)死亡受體發(fā)生寡聚化，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(death inducing signaling complex，DISC)，導(dǎo)致 Caspase-8 激活。研究證實(shí)caspase-8是關(guān)鍵的啟動(dòng)型caspase，其可通過特殊的細(xì)胞信號(hào)途徑導(dǎo)致caspase-3激活，將凋亡信號(hào)傳至caspase-3，caspase-3活化物能裂解DNA修復(fù)酶，使細(xì)胞不可逆地發(fā)生凋亡改變，包括核濃縮和DNA斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。在我們的研究中TTC染色結(jié)果顯示，C組與B組相比較梗死體積顯著縮小，小鼠搜索安全島潛伏期明顯縮短，進(jìn)一步說明姜黃素在小鼠腦缺血再灌注模型中一定程度上減輕了腦損傷和改善了學(xué)習(xí)記憶功能，與文獻(xiàn)報(bào)道［7］一致。Taoufik等［8］研究在永久性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)Caspase-8促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。為了證實(shí)姜黃素是否對(duì)外源性凋亡通路起作用，我們對(duì)Caspase-8進(jìn)行了觀測(cè)，免疫組化及免疫印跡結(jié)果顯示:假手術(shù)組腦組織內(nèi)Caspase-8表達(dá)水平極低，主要表達(dá)在神經(jīng)元的胞漿內(nèi)。在小鼠腦缺血再灌后3 h，大腦皮層Caspase-8蛋白表達(dá)開始增加，并于傷后12 h達(dá)到高峰。而凋亡細(xì)胞檢測(cè)高峰期出現(xiàn)在傷后48 h，Caspase-8的表達(dá)早于凋亡細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)二者的空間表達(dá)具有較強(qiáng)的一致性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者的時(shí)間變化趨勢(shì)具有平行性。提示:Caspase-8參與了局灶性腦缺血后的凋亡過程［9］，加重了缺血再灌注損傷。與模型組比較，免疫組化及免疫印跡結(jié)果均表明姜黃素可顯著減少各對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)Caspase-8的表達(dá)。同時(shí)相關(guān)分析結(jié)果提示Caspase-8陽性細(xì)胞數(shù)與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)趨勢(shì)(r=0.794，P＜0.01)。所以我們推測(cè)姜黃素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一為:減少Caspase-8的表達(dá)，從而減輕細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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2 雷軍榮，秦軍，張晶.姜黃素對(duì)大鼠缺血性腦損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的影響.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26:120-123.

3 李焰，程冉冉，周燕，等.姜黃素對(duì)小鼠腦缺血再灌注的腦組織中NO含量和Bcl-2、Bax表達(dá)的影響.職業(yè)與健康2012，28:1157-1159.

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