賴氨酸本質(zhì)熒光現(xiàn)象初探

趙方方，賈丹丹，劉 純，曹 磊，梁 赫，張俊行，王東軍

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066004；2 天津大學(xué)；3 滄州第三塑料有限公司)

ZHAO Fang-fang,JIA Dan-dan,LIU Chun,CAO Lei,LIANG He,ZHANG Jun-xing,WANG Dong-jun

(1 Hebei Normal University of Science &Technology,Qinhuangdao Hebei,066004;2 Tianjin University;3 the Third Branch of Cangzhou Plastic Co.,Ltd;China)

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賴氨酸本質(zhì)熒光現(xiàn)象初探

趙方方1，賈丹丹1，劉 純1，曹 磊2，梁 赫1，張俊行3，王東軍*

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066004；2 天津大學(xué)；3 滄州第三塑料有限公司)

通過與精氨酸和甘氨酸的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，賴氨酸在可見光區(qū)有較強(qiáng)的熒光，且其吸收也相對(duì)較強(qiáng)。賴氨酸在不同溶劑中熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。同時(shí)對(duì)賴氨酸的熒光壽命進(jìn)行了分析測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，賴氨酸的熒光性質(zhì)明顯區(qū)別于其它氨基酸，這與其特殊6-氨基官能團(tuán)密切相關(guān)，且可歸屬于氮原子的本質(zhì)熒光。

賴氨酸；本質(zhì)熒光；吸收；熒光壽命

近年來一些不含典型熒光基團(tuán)的含氮物質(zhì)可以發(fā)射本質(zhì)熒光(Intrinsic fluorescence)，引起了人們極大的關(guān)注。這些物質(zhì)有大分子，如聚(酰胺-胺)Ploy(amido amines), 聚(氨酯)Poly(amino esters)等，也有小分子，如乙二胺，三乙胺等[1～4]。它們和傳統(tǒng)的有機(jī)熒光物質(zhì)相比，具有毒副作用小，水溶性好等許多優(yōu)良性能，應(yīng)用前景廣闊。雖然人們從濃度、溫度、pH、氧化等[2～7]因素對(duì)此類含氮物質(zhì)的熒光性能進(jìn)行了較深入的研究，但是其熒光發(fā)射機(jī)理仍尚不清楚；目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射熒光，與其所含的氮原子密不可分。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位和生物代謝過程中的重要物質(zhì)。氨基酸的分析對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)，生物化學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究等具有重要意義。其中，色氨酸，酪氨酸和苯丙胺酸等芳香族氨基酸是僅有會(huì)發(fā)熒光的天然氨基酸，它們也是蛋白質(zhì)熒光的主要來源[11～13]，以上三種芳香族氨基酸的熒光研究及其應(yīng)用已有大量報(bào)道[11～17]。但是對(duì)于非芳香族氨基酸的熒光研究卻鮮有報(bào)道，雖然肖子丹等[18]指出賴氨酸可以發(fā)射熒光，但主要是研究氨基酸-金屬配合物現(xiàn)象。

在前期工作基礎(chǔ)上，我們推測氨基酸作為一類含有氮原子的小分子物質(zhì)，也應(yīng)該具有發(fā)射本質(zhì)熒光的特性。本文以賴氨酸(Lysine)，精氨酸(Arginine)和甘氨酸(Glycine)三種典型氨基酸為分析對(duì)象，研究不同氨基酸的本質(zhì)熒光現(xiàn)象。對(duì)比結(jié)果首次驗(yàn)證了，只有含6-氨基的賴氨酸可產(chǎn)生可見區(qū)的本質(zhì)熒光，而大多數(shù)氨基酸中的2-氨基不具有此現(xiàn)象。

1 樣品與方法

賴氨酸、精氨酸和甘氨酸均購自Aldrich公司，無水乙醇為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑，以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，所配待測樣品濃度均為0.5 mol/L。

熒光分光光度計(jì)：日立F-7000，3D掃描速度為30 000 nm/min， 狹縫寬度為EX=2.5 nm，EM=5 nm，步長為3 nm，測試溫度為25 ℃ ，用10×10×40 mm3的比色皿盛放所測樣品。

紫外可見近紅外分光光度計(jì)：日立-2600，狹縫寬度1 nm，掃描速度為中速，測試溫度為室溫，用10×1×40 mm3的比色皿盛放所測樣品。

穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀：愛丁堡FLS-920，激發(fā)光源采用便攜式激光二極管(EPL-375，Edinburgh Instruments),其激發(fā)波長為379 nm，發(fā)射波長為激發(fā)波長所對(duì)應(yīng)的最大熒光強(qiáng)度處的波長，測試溫度為25 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種氨基酸水溶液的熒光對(duì)比

甘氨酸、精氨酸和賴氨酸是三種典型的非芳香性氨基酸。其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其中甘氨酸含有一個(gè)2-氨基；精氨酸除了2-氨基，還含有胍基；賴氨酸具有2,6-氨基。對(duì)0.5 mol/L的賴氨酸、甘氨酸和精氨酸的水溶液進(jìn)行了對(duì)比熒光測試，實(shí)驗(yàn)中首先采用了激發(fā)-發(fā)射矩陣(EEM)測試方法，該方法能夠有效地分析未知熒光現(xiàn)象。結(jié)果表明，賴氨酸在可見光區(qū)有較強(qiáng)的熒光現(xiàn)象(圖2)；而精氨酸在紫外光區(qū)只有很弱的熒光發(fā)射，這與色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等類似[13], 甘氨酸則幾乎沒有熒光發(fā)射。同時(shí)，圖3表明，賴氨酸在可見光區(qū)的熒光強(qiáng)度是精氨酸的數(shù)十倍。由此可見，賴氨酸的熒光性能與其它氨基酸有顯著的區(qū)別。

圖1 從左至右依次為甘氨酸、精氨酸、賴氨酸的結(jié)構(gòu)式

圖2 0.5 mol/L 賴氨酸水溶液的EEM掃描熒光圖譜(箭頭指明其激發(fā)/發(fā)射位置和強(qiáng)度)

根據(jù)傳統(tǒng)有機(jī)熒光理論，賴氨酸并不具有典型的熒光基團(tuán)，但是卻可以發(fā)射可見區(qū)熒光，因此賴氨酸是具有本質(zhì)熒光特性的一種氨基酸，與其分子中的氨基密切相關(guān)。此處可以排除雜質(zhì)的干擾，因?yàn)楣P者對(duì)來自幾個(gè)不同廠家的賴氨酸進(jìn)行熒光測試，發(fā)現(xiàn)均有可見區(qū)熒光現(xiàn)象。通過上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)，我們首次證明了賴氨酸的6-氨基應(yīng)該是產(chǎn)生本質(zhì)熒光的關(guān)鍵基團(tuán)，而其它氨基酸所具有的2-氨基并不能產(chǎn)生本質(zhì)熒光?？赏茰y由于2-氨基與羧基鄰近，羧基的電子效應(yīng)使2-氨基的活性降低，因此只含有2-氨基的甘氨酸和精氨酸很難發(fā)射可見區(qū)本質(zhì)熒光。賴氨酸含有相對(duì)孤立的6-氨基，故而導(dǎo)致了其具有與非芳香性氨基酸不同的熒光現(xiàn)象。

2.2 三種氨基酸水溶液的吸收對(duì)比

如圖4所示，賴氨酸在277 nm和308 nm處有吸收肩峰，而且其吸收強(qiáng)度明顯高于精氨酸和甘氨酸。一般地，在此范圍內(nèi)多出現(xiàn)具有共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子的吸收，但是賴氨酸本身不具有共軛的官能團(tuán)，因此可推測賴氨酸的6-氨基可能出現(xiàn)了團(tuán)聚[8,9]，導(dǎo)致了電子躍遷能級(jí)接近，進(jìn)而產(chǎn)生紅移。與此不同，精氨酸和甘氨酸均未在此波長范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯吸收，可見2-氨基沒有發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，這可能與其電子效應(yīng)和空間位阻有關(guān)。根據(jù)熒光和吸收測定結(jié)果，筆者認(rèn)為賴氨酸的特殊6-氨基官能團(tuán)是其生成熒光中心和生色團(tuán)的關(guān)鍵。

2.3 溶劑對(duì)賴氨酸熒光的影響

為了研究溶劑改變對(duì)賴氨酸熒光性能的影響，實(shí)驗(yàn)中用乙醇改變?nèi)軇┑臉O性。由于賴氨酸微溶于乙醇，為此筆者將賴氨酸溶于無水乙醇和去離子水等體積混合的液體中，得到溶質(zhì)為賴氨酸的溶液的濃度仍為0.5 mol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入無水乙醇的賴氨酸的熒光強(qiáng)度比賴氨酸水溶液的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)，但是對(duì)熒光峰的位置影響卻不大(圖5)。同時(shí)其吸收峰的位置也不變，只是強(qiáng)度略有增加，這說明不同溶劑中賴氨酸的熒光中心沒有發(fā)生變化。

無水乙醇的加入，只使賴氨酸的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說明無水乙醇的加入，并沒有使賴氨酸的熒光中心改變；強(qiáng)度有所增加，其可能原因是：(1)加入了無水乙醇，賴氨酸在不良溶劑中的狀態(tài)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致團(tuán)聚狀態(tài)的改變，改變賴氨酸分子所處的微環(huán)境，從而有助于熒光增強(qiáng)[2,5]；(2)相對(duì)于水溶液，加入無水乙醇后，溶液粘度增大，減少了分子間的碰撞幾率，使無輻射躍遷減少，從而熒光增強(qiáng)。

圖4 0.5 mol/L的賴氨酸(Lysine)、精氨酸(Arginine)、甘氨酸(Glycine)水溶液的紫外可見吸收?qǐng)D譜

圖6 0.5 mol/L賴氨酸水溶液的熒光壽命衰減曲線

2.4 賴氨酸水溶液的熒光壽命

為了分析賴氨酸的熒光中心，對(duì)其水溶液進(jìn)行了熒光壽命的測定。實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)熒光壽命，壽命值分別為0.95,3.11和7.72 ns，圖6顯示的是其壽命衰減曲線。這說明賴氨酸可能具有三個(gè)熒光中心，也可能是一個(gè)熒光中心具有三種不同的微環(huán)境。根據(jù)前期研究結(jié)果，筆者認(rèn)為前一種可能性更大[2,4]。另外，賴氨酸熒光壽命值與其它含氮有機(jī)本質(zhì)熒光壽命值相近[4,10]，此結(jié)果證明了一個(gè)重要結(jié)論，即賴氨酸熒光發(fā)射也應(yīng)歸屬于本質(zhì)熒光。

3 結(jié) 論

相對(duì)于精氨酸和甘氨酸，賴氨酸水溶液在可見光區(qū)出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光發(fā)射，并且吸收也較強(qiáng)，此現(xiàn)象與賴氨酸的6-氨基酸密切相關(guān)。在不同溶劑中賴氨酸的熒光測試表明，其6-氨基的團(tuán)聚是產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的原因。賴氨酸的熒光壽命測定結(jié)果證明三個(gè)熒光中心的存在，而且三個(gè)熒光中心應(yīng)歸屬于本質(zhì)熒光。

致謝:作者感謝河北省自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：E2013407124)和河北省教育廳(項(xiàng)目編號(hào)：ZH2012039,Z2010258)的財(cái)政支持。

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Study on the Intrinsic Fluorescence Phenomenon of Lysine

By the contrast experiments with Arginine and Glycine， Lysine exhibited a stronger fluorescence in the visible region，and its absorption was also relatively higher. Furthermore, the fluorescence intensity of Lyisne changed in different solvents. In addition，the fluorescence lifetime of Lyisne was also analyzed. The results showed that the fluorescence properties of Lysine were significantly different from other amino acids, which was closely related to its special 6-amino functional groups. Meanwhile it is confirmed that the emission of Lysine could be assigned to the intrinsic fluorescence of the nitrogen atom.

Lyisne;intrinsic fluorescence;absorption;fluorescence lifetime

ZHAO Fang-fang,JIA Dan-dan,LIU Chun,CAO Lei,LIANG He,ZHANG Jun-xing,WANG Dong-jun

(1 Hebei Normal University of Science &Technology,Qinhuangdao Hebei,066004;2 Tianjin University;3 the Third Branch of Cangzhou Plastic Co.,Ltd;China)

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.010

趙方方(1987-)，女，碩士研究生。主要研究方向：功能材料化學(xué)。

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：E2013407124)；河北省教育廳(項(xiàng)目編號(hào)：ZH2012039,Z2010258)。

2014-12-12

O631.2+4

A

1672-7983(2015)01-0053-04

*通訊作者，男，博士，教授。主要研究方向：材料化學(xué)。E- mail: wdj9999@126.com。