γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸對肝星狀細胞線粒體功能的影響

張筆覓，孫瑞波，呂智超，楊明靜，李萬良*

(1.吉林省經(jīng)濟管理干部學院，吉林長春 130012；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林長春 130033)

?

γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸對肝星狀細胞線粒體功能的影響

張筆覓1，孫瑞波1，呂智超1，楊明靜2，李萬良2*

(1.吉林省經(jīng)濟管理干部學院，吉林長春 130012；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林長春 130033)

[目的]通過研究γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸(GSAC)對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)線粒體功能的影響，探討GSAC對肝纖維化的抑制作用。[方法]利用微板法測定GSAC對培養(yǎng)24 h細胞線粒體代謝甲基噻唑基四唑(MTT)的影響，以羅丹明123作為染料，通過流式細胞儀檢測線粒體膜電位。[結(jié)果]GSAC具有抑制HSC-T6線粒體代謝MTT的作用，IC50值為0.835 mg/ml；GSAC引起線粒體膜電位崩潰，所有GSAC處理組(0.2、0.4與0.8 mg/ml)羅丹明123熒光強度極顯著高于對照組。[結(jié)論]GSAC可破壞HSC-T6細胞線粒體功能，提示其對肝纖維化具有抑制作用。

γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸；肝星狀細胞；線粒體膜電位；MTT

肝纖維化是一類嚴重危害我國人民健康的疾病，若肝纖維化未及時治療可轉(zhuǎn)變成肝硬化，導致死亡[1]。肝星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSC)是肝臟的一種間質(zhì)細胞，位于肝竇周圍的Disse間隙，HSC可通過調(diào)節(jié)肝臟細胞外間質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)合成與降解，使肝臟保持正常結(jié)構(gòu)[2]。HSC正常時呈靜息狀態(tài)，在肝損傷時，HSC激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，活化的HSC細胞增殖明顯，可表達多種細胞因子及其受體，可使ECM分泌增加造成ECM過度沉積，最終導致肝纖維化的形成，因而HSC在肝纖維化形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[3]。采用化學物質(zhì)直接抑制HSC的增殖，減少ECM產(chǎn)生，理論上可以控制肝纖維化疾病的進程。目前已有很多種產(chǎn)品對肝纖維化具有抑制作用[4]，但作用效果均不十分理想，因而有必要繼續(xù)尋找抑制肝纖維化的有效成分。

大蒜是一種很好的保健食品，具有殺菌、保護心腦血管、解毒等作用。有研究指出大蒜對四氯化碳和乙醇所致的急、慢性肝損傷以及高脂飲食引起的肝臟慢性損傷、可卡因引起的急性肝損傷等均具有較好的保護作用[5]。目前對大蒜保肝功能成分的研究多集中在含硫的揮發(fā)性成分，如二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)等[6]，對于非揮發(fā)性成分研究很少。大蒜中可分離出多種非揮發(fā)性二肽化合物，如γ-L-谷氨酰-S-烯丙基半胱氨酸(γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine，GSAC)、γ-L-谷氨酰甲基半胱氨酸(GSMC)以及γ-L-谷氨酰丙烯基半胱氨酸(GSPC)[7]，其中GSAC是最主要的一種[8]。GSAC是一種非揮發(fā)性化學物質(zhì)，沒有大蒜的強烈刺激氣味，且水溶性好，易于加工，可見該化合物與揮發(fā)性成分比較具有一定優(yōu)勢，有必要對其功能進行深入研究，但目前相關(guān)報道很少。該試驗擬研究GSAC對體外培養(yǎng)HSC-T6細胞線粒體功能的影響，探討GSAC對肝纖維化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝星狀細胞株HSC-T6，從北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司購買，其表型為活化的HSC，可表達高水平的I型膠原，該實驗室自行復蘇，培養(yǎng)，傳代；GSAC，該實驗室從大蒜中提取分離，經(jīng)高效液相檢測純度為95.8%；MTT(Genview公司，BRD)；DMEM(Hyclone公司，USA)；胎牛血清(Hyclone公司，USA)；胰蛋白酶(Sigma公司，USA)；羅丹明123(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 儀器與設備

CO2培養(yǎng)箱(Thermo，USA)；熒光顯微鏡(Nikon-TS100，日本)；倒置顯微鏡(Motic AE2000，中國)；流式細胞儀及CellQuest分析軟件(BD Biosciences，USA)。

1.3 方法

1.3.1 HSC-T6細胞培養(yǎng)。HSC-T6 細胞接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入適量含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%時進行傳代，傳代時用2 ml 0.25%胰酶消化至細胞間隙變寬，部分細胞于瓶底脫落，加入2 ml血清終止消化，以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，以培養(yǎng)基洗滌3次后接種于新培養(yǎng)瓶中。

1.3.2 半數(shù)抑制濃度IC50值測定。采用噻唑藍(MTT)比色法檢測，在Natarajan等[9-10]方法的基礎(chǔ)上進行改進。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至106/ml，接種于96孔板中，每孔加入200 μl 5% CO2，37 ℃培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿96孔微板底，加入質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/ml的GSAC。另以細胞培養(yǎng)液為空白對照，每個濃度設3個平行孔。繼續(xù)孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)繼續(xù)孵育4 h;棄培養(yǎng)液，加入200 μl DMSO，振蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀波長490 nm處測量各孔的吸光值，求出IC50值。

1.3.3 線粒體膜電位檢測。

1.3.3.1 熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。依據(jù)羅丹明123 染色觀察方法[11]，為保證細胞數(shù)量選定小于IC50值處理濃度進行處理。試驗分為空白對照組、0.2 mg/ml GSAC、0.4 mg/ml GSAC與0.8 mg/ml GSAC共4組。將細胞接種于24孔板中，并加入不同質(zhì)量濃度GSAC，每個濃度設3個平行孔，孵育24 h后，加入PBS緩沖液稀釋后的羅丹明 123(5 mg/L)、5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS緩沖液洗滌3次后熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3.3.2 流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位。依據(jù)羅丹明123流式細胞術(shù)操作方法[12]，將細胞接種于6孔板中，分為空白對照組、0.2 mg/ml GSAC、0.4 mg/ml GSAC、0.8 mg/ml GSAC處理組(分別約相當于1/4、1/2 與1倍IC50值)。每組設3個平行孔，孵育24 h，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，各組加入Rhodamine 123 熒光指示劑用以標記活細胞，指示劑終濃度為5 mg/L，于37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)Rhodamine 123 熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)，顯示線粒體膜電位(△ψm)變化(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。經(jīng)CellQuest軟件進行收取和數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理。每項數(shù)據(jù)均為3次重復試驗的結(jié)果，試驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行one-way ANOVA方差分

析，多組數(shù)據(jù)比較用 Least Significant Difference(LSD)test 檢測，P<0.05認為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1IC50值測定

圖1表明，GSAC處理濃度低于0.2 mg/ml時，對HSC-T6細胞MTT代謝活力無明顯影響，且各組抑制率無顯著差異，不具有統(tǒng)計學意義；隨著GSAC濃度的提高，對HSC-T6細胞抑制率逐漸增加。質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml時，對HSC-T6細胞抑制率為10.5%；質(zhì)量濃度為3.2 mg/ml時，對細胞抑制率達85.6%。經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計軟件計算，IC50值為0.835 mg/ml，95%可信區(qū)間為0.470～1.161 mg/ml。

2.2 GSAC對HSC-T6細胞形態(tài)學的影響

分組培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察HSC-T6 細胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2)，空白對照組HSC-T6 細胞無明顯形態(tài)改變，細胞呈星形，星芒狀突起豐富，高倍鏡下細胞核呈圓形或不規(guī)則形，核仁圓形，清晰可見，整體仍呈肌成纖維細胞樣細胞(myofibroblast-like cell，MFB)外形，未見到核染色質(zhì)濃集；GSAC處理組較對照組細胞減少，細胞間隙增寬，隨GSAC濃度增大，上述改變越明顯；0.2和0.4 mg/ml GSAC處理組細胞膜保持完整，可見少部分細胞于瓶底脫落，懸浮于上清液中；0.8、1.6和3.2 mg/ml GSAC處理組可見細胞懸浮、皺縮、壞死、崩解。

2.3 線粒體膜電位檢測

由熒光顯微鏡觀察結(jié)果(圖3)可見，對照組細胞Rhodamine123熒光強度減弱或消失，0.2 mg/ml GSAC處理組中可見個別線粒體受損細胞，0.4與0.8 mg/ml GSAC處理組熒光強度增強。

由流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位結(jié)果(圖4)可見，0.2、0.4、0.8 mg/ml GSAC處理組較對照組熒光強度增強，差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，隨GSAC處理濃度增加，熒光強度依次增強。說明GSAC可導致細胞線粒體膜通透性改變，促進細胞線粒體損傷，且隨濃度增加作用明顯。

3 討論與結(jié)論

線粒體是生物所需能量的生產(chǎn)場所，在大多數(shù)組織細胞中，線粒體的ATP生成量約占細胞的90%，作為細胞內(nèi)主要的ATP生產(chǎn)中心，線粒體在人體衰老、細胞程序性死亡以及信號傳導過程中起非常重要的作用[13]。線粒體功能障礙導致線粒體外膜通透性增大，引起間隙蛋白(如細胞色素C等)的釋放，最終引發(fā)細胞凋亡[14]。因此，通過檢測線粒體功能，可以初步判定GSAC對HSC-T6細胞的影響與機制。噻唑藍為一種黃色、水溶性的物質(zhì)，在線粒體脫氫酶催化下可以代謝轉(zhuǎn)化成藍色的水不溶性甲臜，由于該反應速度與細胞存活或線粒體呼吸功能成正比，因而MTT法可用于定量分析存活細胞數(shù)量或線粒體功能[15]。該試驗中GSAC抑制了MTT代謝，表明其對肝星狀細胞具有毒性作用。

線粒體膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子的不對稱分布形成了線粒體膜電位(△ψm)，△ψm下降是細胞凋亡特異性指標之一[16]。Rhodamine123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，可作為線粒體膜電位指示劑。在正常細胞中可依賴△ψm進入線粒體基質(zhì)中，使其熒光強度減弱，而凋亡細胞由于線粒體膜完整性被破壞，線粒體膜通透性運轉(zhuǎn)孔開放，引起△ψm崩潰，Rhodamine123重新從線粒體釋放于細胞基質(zhì)中，導致熒光強度增強[14]。該研究中，GSAC導致熒光強度增強，說明產(chǎn)生了破壞線粒體膜電位作用?！鳓譵測定結(jié)果進一步證實GSAC通過破壞線粒體膜電位，發(fā)揮對肝星狀細胞的毒性作用。

Ma等[16]研究表明大蒜對化學性肝損傷具有保護作用，通過二甲基亞硝胺(DMN)建立大鼠肝纖維化模型驗證了大蒜對肝細胞具有保護作用，并認為大蒜可能是通過抑制星狀細胞轉(zhuǎn)化成肌纖維細胞，從而拮抗肝纖維化的發(fā)生。且大蒜能明顯降低試驗性肝纖維化大鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，表明大蒜對DMN所致肝纖維化具有保護作用[17]。該研究結(jié)果表明，GSAC是大蒜抑制肝纖維化的一種活性成分，GSAC在體外能夠抑制肝星狀細胞增殖，可破壞肝星狀細胞線粒體功能，引起線粒體跨膜電位下降，表明其對肝形狀細胞具有抑制作用，提示GSAC可能對防止肝纖維化的形成具有積極作用。有關(guān)GSAC如何抑制線粒體功能的深層次作用機制尚不明確。國內(nèi)外多項研究證明一些大蒜中的有機硫化物對腫瘤細胞線粒體功能具有抑制作用，并對其作用機制進行了深層次探究[18-20]。該研究中GSAC可能通過類似的作用機制抑制HSC-T6細胞線粒體功能，具體機理尚待進一步研究。

[1] 李雪梅，彭景華，馮琴.絞股藍總皂苷對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的防治作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2012，22(3)：151-154.

[2] FRIEDMAN S L.Hepatic stellate cells：Protean，multifunctional，and enigmatic cells of the liver [J].Physiological reviews，2008，88(1)：125-172.

[3]申月明，朱萱，張昆和.熊果酸對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響[J].中華肝臟病雜志，2008，16(4)：298-301.

[4] 曉紅，白音夫.植物藥有效成分抗肝纖維化研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2009，8(8)：38-39.

[6]閆淼淼，許真.大蒜功能成分研究進展[J].食品科學，2010，31(5)：312-318.

[7] AMAGASE H，PETESCH B L，MATSUURA H.Intake of garlic and its bioactive components [J].The journal of nutrition，2001，131(3)：955-962.

[8] MARGOT M，BEAT M，ANTHONY D.γ-Glutamyl peptides fromAlliumsativumbulbs[J].Phytochemistry，1992，31(7)：2389-2391.

[9] NATARAJAN M，MOHAN S，MARTINEZ B R.Antioxidant compounds interfere with the 3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide cytotoxicity assay[J].Cancer detection and prevention，2000，24(5)：405-414.

[10] FUNK D，SCHRENK H H，F(xiàn)REI E.Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay [J].Biotechniques，2007，43(2)：178-182.

[11] SHAN M.Proliferation-attenuating and apoptosis-inducing effects of tryptanthrin on human chronic myeloid leukemia K562 cell line in vitro [J].International journal of molecular sciences，2011，12(6)：3831-3845.

[12] WANG J.Synergistic effect of cytokines EPO，IL-3 and SCF on the proliferation，differentiation and apoptosis of erythroid progenitor cells[J].Clinical hemorheology and microcirculation，2007，37(4)：291-299.

[13] NEWMEYER D，F(xiàn)ERGUSON M S.Mitochondria：Releasing power of life and unlcashing the machineries of death [J].Cell，2003，112(4)：481-490.

[14] YANG J G，YU H N，SUN S L.Mechanism of free Zn2+enhancing inhibitory effects of EGCG on the growth of PC-3 cells：Interactions with mitochondria [J].Biological trace element research，2009，131(3)：298-310.

[15] MOSMANN T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays [J].Journal of immunological methods，1983，65(12)：55-63.

[16] MA P，CAO T T，YU M.Effect of quercetin on the proliferation and mitochondrial transmembrane potential of CBRH-7919 cells [J].Agricultural basic science and technology，2012，13(2)：245-247.

[17] YARED J P，STARR N J，TORRES F K.Effects of single dose，post-induction dexamethasone on recovery after car-diac surgery [J].Journal of cardiothoracic and vascular anesthesia，2007，21(1)：68-75.

[18] 朱蘭香，陳衛(wèi)昌，許春芳.大蒜素對二甲基亞硝胺誘發(fā)的肝纖維化大鼠的保護作用[J].中草藥，2004，35(12)：13842-13871.

[19] KIM S H，BOMMAREDDY A，SINGH S V.Garlic constituent diallyl trisulfide suppresses x-linked inhibitor of apoptosis protein in prostate cancer cells in culture and in vivo [J].Cancer prevention research，2011，4(6)：897-906.

[20] SHIN H，CHA Y Y，PARK M S.Diallyl sulfide induces growth inhibition and apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells by mitochondrial signaling pathway [J].Oral Oncology，2010，46(4)：15-18.

Effect of γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine on Mitochondrial Function of Hepatic Stellate Cells

ZHANG Bi-mi1, SUN Rui-bo1, LV Zhi-chao1,LI Wan-liang2*et al

(1.Jilin Province Economic Management Cadre College, Changchun,Jilin 130012; 2.Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun,Jilin 130033)

[Objective] The research aimed to explore inhibition effect of γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine (GSAC) on liver fibrosis by studying the influence of GSAC on the mitochondrial function of rat hepatic stellate cells (HSC-T6).[Method]After 24 h culture in different concentrations of GSAC, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) metabolism was tested, with the median inhibitory concentration (IC50) value obtained in a microplate assay, and mitochondrial membrane potential (MMP) was tested in a flow cytometer assay with Rhodamine 123 as indicator.[Result]GSAC inhibited MTT metabolism, withIC50=0.835 mg/ml, and GSAC inhibited MMP, the fluorescence intensity in GSAC treated groups (0.2, 0.4 and 0.8 mg/ml) significantly increased compared to the control. [Conclusion] GSAC damages mitochondrial function of HSC-T6 cells, which suggests that GSAC has an inhibitory effect on liver fibrosis.

γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine; HSC-T6 cells; Mitochondrial membrane potential; MTT

張筆覓(1989-)，女，吉林長春人，助教，碩士，從事食品科學研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事科技期刊編輯工作。

2015-11-16

S 633.4

A

0517-6611(2015)35-220-03