水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與生物信息學(xué)分析

紀(jì)劍輝， 周穎君， 楊 雯， 謝 晶， 華 慧， 楊立明

(淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 淮安 223300)

轉(zhuǎn)錄因子主要通過與基因5′端上游特定序列進(jìn)行專一性結(jié)合，保證目的基因能夠在特定時間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。Dof轉(zhuǎn)錄因子家族為鋅指蛋白質(zhì)家族的1個亞家族，一般由200至400個氨基酸組成［1-2］。此外，Dof轉(zhuǎn)錄因子還包含2個主要的結(jié)構(gòu)域:1個位于N末端的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，另1個位于C末端的多變調(diào)控結(jié)構(gòu)域。位于N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有52個氨基酸，并且組成1個Zn2+與4個Cys殘基共價結(jié)合的單鋅指結(jié)構(gòu)，此單鋅指結(jié)構(gòu)中，它能夠特異性的結(jié)合包含核心序列5′-T/AAAAG-3′的順式作用元件［1，3］。位于C末端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域從其氨基酸序列上看不具有保守型，這使Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的不同基因在植物中表現(xiàn)為功能多樣性的一個原因［4］。植物中第1個被鑒定報道的是玉米ZmDof1轉(zhuǎn)錄因子基因［5］。此后，其他植物中的Dof基因相繼被預(yù)測和鑒定出來，如擬南芥全基因組中預(yù)測存在36個Dof基因［6］，水稻中存在30個Dof基因［7］，小麥中存在31個Dof基因［8］，大麥中存在26個Dof基因［9］，大豆中存在79個Dof基因［10］，高粱中存在28個Dof基因［11］。目前研究結(jié)果表明Dof轉(zhuǎn)錄因子對植物生長發(fā)育過程中多種生物學(xué)途經(jīng)起作用。如C4植物玉米的碳代謝調(diào)控過程主要通過Dof1和Dof2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控PEPC基因的表達(dá)而起作用［12］;玉米的PBF及其同源的大麥和小麥PBF轉(zhuǎn)錄因子對于胚乳特異性貯藏蛋白質(zhì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用［13］;煙草的 Nt-BBF1基因在頂端分生組織和微管組織中通過響應(yīng)生長素信號從而實現(xiàn)對原癌基因 rolB的表達(dá)調(diào)控［14］;大豆的GmDof4和GmDof11通過調(diào)控脂肪酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控大豆種子的油脂含量［15］;擬南芥Dof家族基因OBP1受到水楊酸和氧化脅迫等處理后，可以調(diào)控植物防御基因的表達(dá)［16］;水稻的OsDof12能夠調(diào)控Hd3a和OsMADS14基因的表達(dá)，最終影響水稻的開花時間［17］。小麥中的Dof基因在種子發(fā)育和生殖生長中起作用［18］。在擬南芥中，有一些Dof基因(如AtDof2.4，AtDof5.8和AtDof5.6/HCA2)被報道為特異性的在一些早期的生長組織中高效表達(dá)［19-20］。

本試驗利用生物信息學(xué)的方法獲取和鑒定了水稻、擬南芥、二穗短柄草以及高粱的Dof基因序列，并對其同源基因進(jìn)行了聚類分析，從而探索其可能存在的進(jìn)化規(guī)律。另外，通過分析水稻Dof基因在不同組織中的表達(dá)情況，從而為進(jìn)一步揭示Dof轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的數(shù)據(jù)收集與分析

利用 Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)，以擬南芥Dof同源蛋白質(zhì)檢索Dof家族蛋白質(zhì)特征結(jié)構(gòu)域［21］，標(biāo)號為 PF02701。隨后從水稻TIGR基因組數(shù)據(jù)庫下載水稻全基因組序列，其次利用HMMER3程序(http://hmmer.janelia.org/)以PF02701隱馬可夫模型對水稻全基因組序列搜索含有Trihelix結(jié)構(gòu)域特征的序列(E≤10-10被認(rèn)為是候選蛋白質(zhì))。最后利用SMART在線程序檢測候選蛋白質(zhì)序列，去除不含Dof結(jié)構(gòu)域特征的序列［22］。利用TFDB數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.cbi.edu.cn/index.php，v3.0)［23］獲得擬南芥、玉米、二穗短柄草和高粱的Trihelix基因序列。

1.2 水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序的鑒定和分析

為了分析水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，利用MEME在線程序 (http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)［24］對候選水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子的基序進(jìn)行了分析，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:(1)基序重復(fù)的數(shù)量為any;(2)基序的長度為6～200; (3)基序的數(shù)量設(shè)置為10。

1.3 多序列聯(lián)配、蛋白質(zhì)保守序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用Cluster 3.0程序?qū)蜻x水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)域氨基酸進(jìn)行多序列聯(lián)配分析［25］。利用WebLogo程序圖示化候選水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)域氨基酸的保守性［26］，之后序列聯(lián)配比對結(jié)果通過Mega5程序(http://www.megasoftware.net/)［27］進(jìn)行分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining Method，NJ)生成水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)域的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹校驗參數(shù)Bootstrap設(shè)為1 000次重復(fù)，以同樣的方法對水稻、擬南芥、二穗短柄草、玉米和高粱中Dof轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.4 不同物種中Dof基因家族所在染色體區(qū)段復(fù)制分析

利用植物基因組復(fù)制數(shù)據(jù)庫PGDD(http:// chibba.agtec.uga.edu/duplication/)［28］對候選水稻Dof基因所在染色體區(qū)段的復(fù)制進(jìn)行分析。Dof基因在水稻染色體上的復(fù)制情況通過MapInspect(http://www.dpw.wau.nl/pv/pub/MapComp/)軟件進(jìn)行構(gòu)建;水稻與二穗短柄草，水稻與高粱之間Dof基因所在區(qū)段染色體的復(fù)制情況通過Circos(http:// circos.ca/)軟件進(jìn)行構(gòu)建［29］。

1.5 水稻Dof基因在不同組織表達(dá)水平分析

利用水稻 Ricexpro在線芯片數(shù)據(jù)(http:// ricexpro.dna.affrc.go.jp/data-set.html)分析水稻Dof基因在不同組織部位的表達(dá)情況。這些組織部位包括水稻的葉片、葉鞘、根、莖、穗、花藥、雌蕊、外稃、內(nèi)稃、胚珠、胚和胚乳。樣本包含三組重復(fù)，采用的是Agilent在線表達(dá)譜芯片分析系統(tǒng)(Agilent onecolor(Cy3)microarray-based gene analysis system)。所有這些Dof基因在水稻不同組織中的表達(dá)水平通過Cluster 3.0程序?qū)ζ溥M(jìn)行層次聚類分析，再通過TreeView軟件(http://jtreeview.sourceforge.net/)對其結(jié)果進(jìn)行Heatmap圖示［30］。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

利用Pfam程序和SMART數(shù)據(jù)庫，我們鑒定到30個含有Dof典型結(jié)構(gòu)域的水稻轉(zhuǎn)錄因子，隨后我們利用Clustal X程序?qū)@些Dof轉(zhuǎn)錄因子的Dof結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(圖1A)，通過圖1A可以明顯看出這30個Dof轉(zhuǎn)錄因子均含有一個明顯的鋅指結(jié)構(gòu)，且鋅指結(jié)構(gòu)內(nèi)均含有保守的4個Cys(圖1B)。

圖1 Dof結(jié)構(gòu)域在水稻中的保守性分析Fig.1 The conservation analysis of Dof domain in rice

2.2 Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化

我們通過Cluster 3.0程序?qū)λ綝of結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對，然后運(yùn)用Mega5軟件對Dof的保守區(qū)域進(jìn)行進(jìn)化分析(圖2)。從圖2可以看出，雖然水稻中的Dof基因具有較高的同源性，但其仍然可以明顯的區(qū)分出差異性，我們初步將其分成6個亞家族(自舉值≤50%)。為了更好地分析水稻和其他植物Dof轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化上的關(guān)系，我們又對水稻、擬南芥、二穗短柄草、玉米和高粱中的Dof轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了進(jìn)化分析(圖3)，并初步將這5個物種中的Dof轉(zhuǎn)錄因子按照其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分成8個分支。整體來看，每一個分支提示其可能在物種演化過程中具有更高的序列相似性。此外，除了第V家族均為擬南芥基因外，每一個物種在另外7個分支上都存在相關(guān)基因。

圖2 水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化及水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子的基序Fig.2 The phylogenetic tree of the Dof transcription factor family and the MEME-defined motifs of rice Dof family

圖3 水稻、擬南芥、二穗短柄草、玉米和高粱中Dof轉(zhuǎn)錄因子的比較進(jìn)化樹Fig.3 Comparative phylogenetic tree of Dof family constructed using the neighbor-joining method in rice，Arabidopsis，Sorghum，maize and Brochypodium distachyon

2.3 水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)氨基酸基序

我們利用MeMe在線程序?qū)λ綝of轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)氨基酸基序進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子除了均含有Dof典型保守基序Motif1之外，還含有其他一些相對保守的基序。從圖2我們可以看出第VI亞家族Os01g15900、Os07g48570、Os01g17000、Os03g07360和Os10g26620這5個基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列的C端均含有Motif2和5兩個基序，而后3個基因Os01g15900、Os07g48570、Os01g17000編碼的蛋白質(zhì)在序列中部還含有Motif10基序，以及在核心保守基序Motif1的左側(cè)緊連Motif9，因此推測這3個基因相對親緣關(guān)系更加靠近。在第IV亞家族中，部分轉(zhuǎn)錄因子在Motif1的左側(cè)含有Motif4基序，但這一基序并沒有在IV亞家族所有轉(zhuǎn)錄因子中出現(xiàn)。

2.4 水稻Dof基因的染色體復(fù)制

在物種進(jìn)化過程中，不單只有1個基因在不同物種之間存在親緣關(guān)系，在一定的染色體區(qū)段上，同樣存在進(jìn)化上的復(fù)制關(guān)系。為了研究這種染色體區(qū)段的進(jìn)化，我們通過PGDD數(shù)據(jù)庫及MapInspect軟件來分析水稻30個Dof轉(zhuǎn)錄因子是否在水稻自身存在某些染色體區(qū)段的復(fù)制。從圖4可以看出，水稻Dof基因分布在除11號染色體之外的其他所有染色體上面，其中1號和3號染色體分布最多，分別有6個Dof基因，6、8和9號染色體上分布最少，各有1個Dof基因。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，這30個Dof基因在染色體上的分布也存在聚集現(xiàn)象，如在1號染色體的9 Mb、2號染色體的29 Mb、3號染色體的22 Mb和32 Mb、12號染色體的23 Mb位置都存在2個或2個以上基因集中分布的現(xiàn)象。另外，從表1也可以看出，具有大量基因所在的染色體復(fù)制區(qū)域有6個，少量基因所在染色體復(fù)制區(qū)域有5個。除了8號染色體上的Os08g38220基因不存在跟其他染色體的復(fù)制，其他染色體均有Dof基因存在跟其他染色體的復(fù)制情況。Os01g48290和Os01g55340 2個基因在1號染色體長臂上存在染色體復(fù)制，但這種復(fù)制的區(qū)段并不是很大，從我們的檢測結(jié)果看僅僅只有10個基因在該區(qū)段存在同源性。此外，Os03g60630分別與Os07g13260、Os05g02150 2個基因的區(qū)段存在復(fù)制情況，但兩者的復(fù)制情況并不完全相同，Os03g60630與Os07g13260具有100個基因區(qū)段復(fù)制，而Os03g60630與Os05g02150在相關(guān)區(qū)段則僅有8個基因復(fù)制(表1)。

圖4 水稻Dof基因在染色體上的復(fù)制Fig.4 Chromosomal locations，region duplications，and predicted clusters of rice Dof genes

2.5 Dof基因在水稻和高粱以及水稻和二穗短柄草之間染色體復(fù)制

由于水稻、高粱和二穗短柄草作為單子葉中較具代表性的作物且相互間具有較高的親緣性，因此我們利用生物信息學(xué)方法對水稻、高粱和二穗短柄草之間的染色體復(fù)制情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在水稻中有 22個 Dof基 因 (Os01g09720、Os02g15350、Os03g16850、Os03g38870、Os04g58190、Os07g32510、Os09g29960和Os12g39990除外)與二穗短柄草中的Dof基因具有線性同源性(圖5A);25個Dof基因(O-s01g09720、Os02g15350、Os03g38870、Os06g17410和Os07g32510除外)與高粱中Dof基因具有線性同源性(圖5B)。推測這些基因在進(jìn)化過程中經(jīng)歷復(fù)制、重排和缺失，導(dǎo)致一些同源基因的丟失。

2.6 Dof基因在水稻不同組織中的表達(dá)

為了分析水稻Dof基因在不同組織的表達(dá)情況，我們利用RiceXPro數(shù)據(jù)庫(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/data-set.html)下載水稻Dof基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示Dof基因的表達(dá)幾乎涉及整個植物的生長過程，我們首先將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，然后通過構(gòu)建Heatmap圖綜合分析了這些Dof基因在水稻中的表達(dá)情況，并用Cluster和Treeview程序加以圖示化(圖6)。結(jié)合Cluster的結(jié)果，我們將27個基因的表達(dá)聚類分成6個不同的亞區(qū)，不同的亞區(qū)提示其具有相似或者相近的表達(dá)譜。從Heatmap圖可以看出，位于VI亞區(qū)的Os10g26620、Os06g17410、Os05g02150 3個基因主要在葉片和葉鞘的不同時期具有較高的表達(dá)量，提示其可能主要參與葉片的發(fā)育過程;位于 V亞區(qū)的 Os04g47990、Os02g45200、Os07g32510、Os03g60630 4個基因主要在根和莖的組織中具有較高的表達(dá);III亞區(qū)的Os08g38220、Os05g36900、Os10g35300、Os04g58990、Os01g64590 5個基因的表達(dá)則主要集中于根部以及花器官組織中(花藥、雌蕊、外稃、內(nèi)稃、胚珠);II亞區(qū)的Os03g-55610、Os03g42200、Os12g38200、Os05g02150、Os0-2g47810、Os01g55340 6個基因則分別在穗、雌蕊、胚中具有高表達(dá)，但是在花藥中的表達(dá)卻并不高，這提示他們的功能可能與雌配子的發(fā)育相關(guān)。

3 討論

表1 水稻Dof基因在染色體上的復(fù)制分析Table 1 Duplicated Dof genes in rice chromosomes

本研究通過對水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子全基因組分析，共獲得了30個具有明顯保守Dof結(jié)構(gòu)域特征的基因，通過對這30個Dof基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析，我們發(fā)現(xiàn)Dof基因存在保守結(jié)構(gòu)域特征，且這些結(jié)構(gòu)域的特征與Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的分類具有一致性。此外，我們結(jié)合水稻內(nèi)部以及水稻和其他物種之間的染色體復(fù)制情況，對Dof基因的進(jìn)化規(guī)律做了進(jìn)一步的分析。在基因進(jìn)化過程中，基因復(fù)制是基因家族擴(kuò)張過程中的重要事件，復(fù)制的基因能夠為新基因的產(chǎn)生和功能分化提供物質(zhì)前提，因此，研究基因復(fù)制以及局部染色體的復(fù)制能夠幫助研究者更好地認(rèn)識基因和物種的進(jìn)化。本試驗中我們對水稻內(nèi)部以及水稻和其他物種之間的基因線性同源關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在水稻內(nèi)部以及水稻和其他物種之間均存在著大量的同源基因，但水稻中也有少數(shù)Dof基因與其他物種不存在線性同源關(guān)系，依此我們推測Dof在進(jìn)化過程中通過復(fù)制得到了擴(kuò)增，但有少量基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了選擇性缺失。

圖5 Dof基因在水稻和二穗短柄草及水稻和高粱間的染色體線性復(fù)制Fig.5 The chromosome synteny and replication of Dof genes in rice and Brochypodium distachyon，and in rice and sorghum

目前在水稻中只有3個Dof基因被克隆和分析，第1個是Os03g07360(OsDof12)［17，31］，該基因過表達(dá)后，在長日照條件下通過調(diào)控Hd3a和OsMADS14的表達(dá)水平來促進(jìn)水稻的開花。在我們的研究中，通過表達(dá)譜分析可以看出，位于表達(dá)譜I亞區(qū)的Os03g07360基因在花序(0.6～1.0 cm;3.0～4.0 cm)、外稃(小花7.0 mm)、內(nèi)稃(小花7.0 mm)以及雌蕊(穗長10.0～14.0 cm)中高表達(dá)，表明其可能與花器官發(fā)育相關(guān)，但我們也發(fā)現(xiàn)，該基因在不同長度的花藥組織中均沒有高表達(dá)，因此推斷該基因可能并不影響雄配子體的發(fā)育。第2個報道的基因是Os03g38870(OsDof3)［32-33］，該基因被認(rèn)為參與種子發(fā)育的調(diào)控過程，它的表達(dá)主要集中于發(fā)芽的種子，并且通過赤霉素信號途徑在水稻種子萌發(fā)過程起作用。從本研究圖6可以發(fā)現(xiàn)該基因在子房、胚和胚乳中均呈現(xiàn)出高表達(dá)。第 3個基因是 Os08g38220 (OsDof25)［34］，研究者通過在擬南芥中過度表達(dá)OsD-of25基因，發(fā)現(xiàn)其能夠改變碳氮代謝，從而增加了氨基酸的濃度，此外，該基因還被發(fā)現(xiàn)能夠提高氨的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtAMT1.1 and AtAMT2.1)的表達(dá)水平以及抑制硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtNRT2.1)的表達(dá)。從本研究圖6可以發(fā)現(xiàn)該基因在花藥、雌蕊、外稃和內(nèi)稃中均呈現(xiàn)出高表達(dá)。我們認(rèn)為基因的表達(dá)模式與基因的功能有著密切的關(guān)系，相關(guān)基因的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)能為水稻Dof轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步的功能驗證提供線索。

圖6 Dof基因在水稻不同組織不同時間的表達(dá)Heatmap圖分析Fig.6 Heatmap representation and hierarchical clustering of rice Dof transcription factor genes in different rice tissues

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